Dampak fungisida dan insektisida terhadap kunjungan penyerbuk dan kebugaran bunga liar

Abstrak

1. Penggunaan pestisida telah meluas di seluruh dunia, dan semakin banyak bukti yang menunjukkan dampaknya terhadap kesehatan serangga nontarget seperti lebah. Namun, masih sedikit yang diketahui tentang apakah keberadaan bahan kimia ini dalam jaringan tanaman dapat mengubah interaksi antara tanaman, penyerbuk, dan mikroba bunga. Di sini kami menanyakan apakah keberadaan insektisida dan fungisida mengubah kunjungan penyerbuk, kelimpahan jamur bunga, dan pembentukan biji.
2. Kami memperlakukan bunga liar Penstemon strictus ( N  = 126) dengan produk yang tersedia secara komersial yang mengandung insektisida imidakloprid, fungisida tebukonazol, kombinasi kedua produk, atau pengendali air.
3. Kami menemukan prediktor terbaik untuk kunjungan penyerbuk adalah jumlah bunga, bukan perlakuan; meskipun jumlah bunga secara tidak langsung meningkatkan kunjungan pada tanaman yang diobati dengan fungisida dan tanaman yang diobati dengan kombinasi kedua bahan kimia tersebut, jumlah bunga yang lebih sedikit mengurangi kunjungan pada tanaman yang diobati dengan insektisida. Tidak ada pola yang jelas yang muncul dalam kelimpahan jamur bunga, yang tidak terlalu terpengaruh oleh tingkat kunjungan atau perlakuan kimia. Terakhir, jumlah dan massa biji berhubungan positif dengan kunjungan. Namun, meskipun tanaman yang diobati dengan fungisida saja atau dalam kombinasi menerima kunjungan terbanyak, jumlah dan massa biji lebih rendah dari yang diharapkan dalam perlakuan ini, dan kami menemukan bukti adanya efek negatif langsung dari semua perlakuan kimia pada metrik biji (meskipun efek ini bervariasi).
4. Studi ini menunjukkan bahwa tanaman yang mengandung bahan kimia berbahaya dapat dikunjungi sesering, jika tidak lebih, daripada tanaman yang tidak mengandung bahan kimia. Kontaminasi bunga liar yang tidak disengaja dengan berbagai bahan kimia pertanian semakin umum terjadi dan berisiko membentuk perangkap ekologis bagi penyerbuk yang tidak terhalang oleh tanaman yang menimbulkan risiko kesehatan. Terakhir, dampak pestisida pada tanaman liar jarang dipertimbangkan, dan kami mendesak penelitian di masa mendatang untuk lebih jauh meneliti konsekuensi hilir dari paparan terhadap kebugaran tanaman liar ini.

Baca Ringkasan Bahasa Sederhana gratis untuk artikel ini di blog Jurnal.
1. PENDAHULUAN
Penyerbuk memainkan peran penting dalam pemeliharaan keanekaragaman hayati, karena 75% tanaman pangan dan 94% tanaman berbunga liar bergantung pada penyerbuk untuk reproduksi (Klein et al., 2007 ; Ollerton et al., 2011 ). Oleh karena itu, penurunan penyerbuk telah menarik perhatian global (Wagner, 2020 ; Zattara & Aizen, 2021 ). Penelitian terkini telah mengaitkan penurunan populasi penyerbuk dengan kombinasi stresor yang disebabkan manusia, salah satunya adalah meluasnya penggunaan bahan kimia pertanian (Janousek et al., 2023 ; Zattara & Aizen, 2021 ). Pestisida (misalnya insektisida dan fungisida), dan khususnya insektisida neonikotinoid, dapat ditemukan di jaringan berbagai taksa tanaman dan telah ada di mana-mana di lingkungan pertanian serta daerah perkotaan, pinggiran kota, dan bahkan konservasi (Halsch et al., 2020 ; Zioga et al., 2020 ). Namun, pestisida tunggal jarang terdeteksi secara terpisah dan sebaliknya sering terdeteksi bersamaan dengan bahan kimia lain dan bahkan kelas bahan kimia lain (David et al., 2016 ; Halsch et al., 2020 ; Zioga et al., 2020 ). Oleh karena itu, memahami efek kombinatorial, atau sinergis, dari insektisida dan fungisida merupakan bidang studi yang aktif (Goulson et al., 2015 ; Raimets et al., 2018 ; Tosi et al., 2022 ).

Paparan pestisida langsung (konsumsi atau semprotan) diketahui memiliki efek berbahaya pada kesehatan penyerbuk dan layanan penyerbukan (Cullen et al., 2019 ; Goulson et al., 2015 ; Stanley et al., 2015 ; Tosi et al., 2022 ), tetapi lebih sedikit penelitian yang mengeksplorasi apakah keberadaan beberapa bahan kimia dalam bunga liar mengubah interaksi tanaman-penyerbuk dengan cara yang penting bagi kebugaran tanaman. Misalnya, mengingat kontaminasi bunga oleh beberapa bahan kimia pertanian mungkin tidak dapat dihindari di banyak tempat (misalnya tempat perlindungan satwa liar, penanaman yang ramah penyerbuk di lingkungan perkotaan dan pinggiran kota, jalur bunga di lingkungan pertanian), penting untuk bertanya: apakah bahan kimia ini mengubah sifat bunga dengan cara yang memengaruhi kunjungan? Dari perspektif tanaman, pestisida umumnya bermanfaat bagi fisiologi tanaman, meningkatkan tinggi, luas daun, dan panjang akar (Georgieva et al., 2017 ). Perubahan fisiologis ini dapat secara tidak langsung memengaruhi kunjungan penyerbuk dengan mengubah sifat-sifat yang dievaluasi penyerbuk saat membuat keputusan mencari makan, yang mungkin mengubah preferensi penyerbuk (Klatt et al., 2023 ). Dari perspektif penyerbuk, tidak pasti apakah bahan kimia berbahaya pada tanaman akan bertindak sebagai pencegah. Lebah dalam uji pilihan terkontrol tertentu dapat mengembangkan preferensi yang tidak dapat dijelaskan untuk neonikotinoid (Arce et al., 2018 ), meskipun tidak ada preferensi yang diamati dalam uji lain (Muth et al., 2020 ). Sementara lebah akan dengan mudah mendatangi tanaman yang diobati dengan herbisida (Russo et al., 2020 ; Thompson et al., 2022 ), pengobatan dengan insektisida atau fungisida dapat memiliki efek yang beragam pada kunjungan penyerbuk, dan penelitian ini sering kali melibatkan lebah yang dikelola dan spesies tanaman yang dibudidayakan di rumah kaca atau lingkungan pertanian (Olaya-Arenas et al., 2020 ; Schaeffer et al., 2020 ; Tamburini et al., 2021 ; Wei et al., 2021 ). Oleh karena itu, masih belum jelas bagaimana temuan ini akan diterapkan pada spesies tanaman liar atau komunitas penyerbuk asli.

Selain efek langsung pada sifat bunga dan penyerbuk, rute lain di mana bahan kimia pertanian dapat mengubah interaksi tanaman-penyerbuk adalah melalui pihak ketiga mikroba. Nektar bunga menampung komunitas mikroba termasuk jamur yang disebarkan oleh penyerbuk dan mungkin juga memiliki relevansi ekologis bagi lebah (misalnya sebagai sumber probiotik yang bermanfaat dan makanan untuk larva yang sedang berkembang: Bosmans et al., 2018 ; Francis et al., 2021 ; Keller et al., 2021 ; Pozo et al., 2020 ). Mikroba bunga dapat mengubah kualitas nektar secara kimiawi (Vannette et al., 2012 ), dan zat volatil yang diproduksi secara mikroba dapat menarik lebah (Rering et al., 2018 ; Schaeffer et al., 2019 ). Fungisida telah terbukti berdampak negatif pada keanekaragaman jamur bunga (Bartlewicz et al., 2016 ; Schaeffer et al., 2017 ; Wei et al., 2021 ), tetapi dampak insektisida pada jamur bunga kurang jelas dan dapat bergantung pada konsentrasi (Cecala & Vannette, 2024 ). Oleh karena itu, perubahan pada kelimpahan mikroba bunga berpotensi memengaruhi kesehatan lebah (dengan mengubah nilai gizi nektar dan/atau mengubah sumber mikroba usus) dan penyerbukan (dengan mengubah bunga mana yang dikunjungi lebah dan seberapa sering).

Terakhir, setiap perubahan yang disebabkan pestisida dalam interaksi dengan penyerbuk dan mikroba dapat berdampak pada kebugaran tanaman. Hampir semua pemahaman kita tentang dampak insektisida dan fungisida pada kebugaran tanaman berasal dari literatur tanaman pangan, yang menunjukkan efek positif ketika bahan kimia ini digunakan sebagaimana mestinya. Misalnya, perawatan fungisida pada tanaman pangan dapat meningkatkan hasil panen ketika patogen jamur hadir (Rothrock et al., 2012 ; Swoboda & Pedersen, 2009 ). Insektisida juga dapat meningkatkan hasil panen jika digunakan untuk mengendalikan populasi hama (Milosavljević et al., 2019 ), tetapi dapat menurunkan hasil panen dengan mengganggu layanan penyerbukan (Stanley et al., 2015 ; Tamburini et al., 2021 ). Sistem alami mungkin tidak terlalu membutuhkan pengendalian hama dan patogen buatan, karena cenderung lebih beragam dan memiliki lebih banyak musuh alami (Albrecht et al., 2020 ; Morandin et al., 2016 ), namun, bahan kimia ini masih tersebar luas di berbagai lanskap (Halsch et al., 2020 ). Oleh karena itu, sistem alami mungkin tidak mendapat manfaat dari paparan fungisida atau insektisida, yang menyoroti pentingnya memeriksa konsekuensi kebugaran pada bunga liar.

Memahami perubahan yang disebabkan pestisida pada tanaman, mikroba, dan daya tarik penyerbuk adalah pertanyaan yang sangat relevan mengingat inisiatif yang meluas untuk menanam bunga liar yang ramah penyerbuk di lingkungan perkotaan, pinggiran kota, dan pertanian yang secara tidak sengaja dapat memaparkan penyerbuk pada pestisida (Fountain, 2022 ; Rundlöf et al., 2022 ; Williams et al., 2015 ). Sejauh mana pestisida memengaruhi kebugaran bunga liar non-target dapat berimplikasi pada upaya pengelolaan dan pemulihan. Dengan menggunakan eksperimen semi-lapangan, kami bertujuan untuk memeriksa dampak insektisida neonicotinoid, fungisida, dan kombinasinya pada bunga liar yang umum di AS Bagian Barat, Rocky Mountain Penstemon ( Penstemon strictus ). Di sini kami menanyakan apakah perlakuan ini mengubah (Q1) kunjungan penyerbuk dan sejauh mana perbedaan kunjungan dipengaruhi oleh ukuran tampilan bunga dan sifat tanaman lainnya; (Q2) kelimpahan jamur bunga dan sejauh mana perbedaan dipengaruhi oleh kunjungan penyerbuk; (Q3) produksi benih dan sejauh mana perbedaan benih dipengaruhi oleh kunjungan penyerbuk (Gambar 1 ).

2 METODE
2.1 Situs
Studi ini berlangsung dari 16 Juni hingga 27 Juli 2021 di padang rumput terbuka di Oxbow Nature Study Area (39°30′51.1″ LU, 119°50′58.9″ BB), kawasan lindung seluas 8,9 hektar di Reno, Nevada. Izin untuk studi ini diberikan oleh Truckee Meadows Park Foundation. Taman ini berisi padang rumput terbuka kecil yang didominasi oleh showy milkweed ( Asclepias speciosa ), musk thistle ( Carduus nutans ), dan hairy vetch ( Vicia villosa ). Situs ini memiliki kelimpahan lebah yang tinggi yang diamati pada musim panas sebelumnya, yang mencakup beberapa spesies lebah bumble ( Bombus vosnesenskii , B. nevadensis, B. huntii ) dan lebah longhorn ( Melissodes robustior , M. agilis ; spesimen voucher diserahkan ke Museum of Natural History di University of Nevada, Reno). Taman itu sendiri diakuisisi dari Biro Pengelolaan Lahan pada tahun 1960 dan belum diketahui adanya penggunaan insektisida atau fungisida baru-baru ini.

2.2 Tumbuhan
Kami memperoleh Rocky Mountain Penstemon ( Penstemon strictus ; Tabel 1 ; N = 126) yang sedang berbunga  dari petani organik dengan benih yang bersumber dari daerah setempat (VitalBeeBuds LLC, Gardnerville, Nevada; tanaman bebas dari residu pestisida yang berbahaya: lihat Bagian 3). Tanaman ini merupakan tanaman tahunan asli dalam famili Figwort ( Scrophulariaceae ) yang dibudidayakan dan tumbuh secara alami di Amerika Serikat Bagian Barat. Tanaman ini terutama diserbuki oleh burung kolibri dan lebah dalam famili Apidae (Castellanos et al., 2003 ).

Tanaman dipindahkan ke dalam pot plastik 11,35 L dengan campuran tanah organik (rasio 2 Kellogg Amend Organic Plus: 1 Kellogg Patio Plus Organic Plus). Kami membungkus pot dengan pagar logam setinggi 3 meter untuk melindungi dari herbivori mamalia (rusa) dan menutupi bagian atas dengan kain peneduh persegi 0,25 m untuk mencegah panas berlebih. Tanaman disiram tiga kali seminggu sekitar pukul 9:00 pagi.

Tanaman diberikan salah satu dari tiga perlakuan eksperimental (fungisida, insektisida, atau kombinasinya) atau pengendalian air. Penugasan perlakuan diacak dalam tahap fenologi (berbunga, bertunas, atau vegetatif) dan setiap perlakuan diulang 32 kali dalam rancangan blok acak (kecuali blok 32 yang hanya memiliki insektisida dan tanaman kontrol). Perlakuan diterapkan pada 06 Juni 2021. Insektisida diaplikasikan langsung ke tanah sebagai produk ‘Bioadvanced Fruit, Citrus & Vegetable Insect Protection’ (SBM Company, McClellan Park, CA) yang mengandung 0,235% neonicotinoid imidacloprid sebagai bahan aktif. Fungisida diaplikasikan sebagai semprotan daun sebagai produk ‘Bioadvanced Disease Control for Roses, Flowers, & Shrubs’ yang mengandung 2,9% tebuconazole sebagai bahan aktif. Bahan kimia ini diaplikasikan sesuai dengan protokol pabrik pembuatnya dan dua kontrol air (aplikasi tanah dan/atau semprotan daun) juga diaplikasikan sedemikian rupa sehingga setiap tanaman menerima aplikasi tanah dan semprotan daun dari beberapa jenis. Untuk memverifikasi penyerapan perawatan insektisida dan fungisida kami pada tanaman fokus kami, kami mengumpulkan sampel jaringan daun dan bunga dari pra-perawatan ( n  = 8, dikumpulkan 1 hari sebelum perawatan pada 05 Juni 2021) dan tanaman yang dirawat ( n  = 5 per perawatan, dikumpulkan 19 hari setelah perawatan pada 25 Juni 2021) yang diekstraksi menggunakan protokol QuEChERS yang dimodifikasi (Stoner & Eitzer, 2012 ) dan dianalisis di Fasilitas Spektrometri Massa Negara Bagian Montana menggunakan LC–MS. Rincian tambahan mengenai rincian analisis residu pestisida ditemukan dalam suplemen.

Kami mencatat tanggal pembungaan, jumlah bunga per tanaman, tinggi tanaman, dan kerusakan akibat herbivori setiap minggu. Kerusakan akibat herbivori diperkirakan secara visual sebagai persentase kerusakan di seluruh tanaman; ini kemudian diubah menjadi survei biner (ya/tidak) tentang keberadaan kerusakan akibat herbivori untuk memperhitungkan bias pengamat. Pada akhir percobaan, kami mengumpulkan dan membedah semua buah sehingga bijinya dapat dihitung dan ditimbang.

2.3 Penyerbuk
Dimulai 10 hari setelah perawatan, kami mengamati kunjungan 3 hari seminggu, mengamati setiap blok dengan tanaman berbunga selama 5 menit/hari, mencatat tanaman mana yang dikunjungi dan berapa banyak bunga yang dimasuki setiap pengunjung. Pengunjung diidentifikasi berdasarkan sayap hingga famili. Setelah pengamatan kunjungan, kami mengumpulkan spesimen voucher semua serangga yang memasuki mahkota bunga selama 60 menit. Spesimen diidentifikasi berdasarkan genus menggunakan kunci dikotomi (Michener et al., 1994 ) dan disimpan di Museum Sejarah Alam di Universitas Nevada, Reno. Penelitian ini tidak memerlukan persetujuan etis untuk penggunaan serangga.

2.4 Kelimpahan jamur bunga
Kami memperkirakan kelimpahan jamur bunga pada 31 tanaman individu di tingkat seluruh tanaman (6 tanaman kontrol, 8 tanaman yang diobati dengan fungisida, 7 tanaman yang diobati dengan insektisida, dan 10 yang menerima fungisida dan insektisida). Kami mengumpulkan bunga utuh (maksimum 10 bunga per tanaman) dari 25 Juni 2021 hingga 07 Juli 2021, membiarkan bunga yang tersisa berbiji. Bunga disuspensikan dalam 20 mL buffer PBS-Tween 1×-0,1% dan diaduk untuk mengekstrak mikroba. Untuk memperkirakan kelimpahan jamur bunga, 200 μL bilasan bunga ditaburkan pada media agar ragi (YMA; Difco, Sparks, MD, AS) dengan kloramfenikol (100 mg L −1 cf) untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Plat diinkubasi selama 48 jam pada suhu 25°C. Unit pembentuk koloni (CFU) dihitung dan jumlah total CFU dibagi dengan jumlah bunga (1–10) yang digunakan dalam pembilasan bunga untuk mengendalikan perbedaan volume jamur bunga awal.

2.5 Analisis
Semua analisis statistik dilakukan dalam R versi 4.2.2 (Tim Inti R, 2022 ). Kami menggunakan kerangka kerja analisis jalur konfirmatori untuk mengukur serangkaian hubungan apriori langsung dan tidak langsung antara sifat tanaman tertentu, kunjungan, kelimpahan jamur bunga, dan pembentukan biji (model konseptual: Gambar 1 ). Kami menggunakan paket Lavaan (Rosseel, 2012 ) untuk menyesuaikan model kami jika memungkinkan. Untuk model yang menyertakan variabel respons binomial (yaitu Q1), kami menggunakan paket piecewiseSEM (Lefcheck, 2016 ) yang memungkinkan penyertaan beberapa struktur kesalahan yang berbeda (Poisson, Gaussian, dan binomial). Kami menggunakan metode standarisasi ‘Menard.OE’ untuk memperkirakan koefisien beta di seluruh variabel pada skala yang berbeda dan menilai kesesuaian model secara keseluruhan menggunakan Fisher’s C dan uji signifikansi terkait. Kami memperkirakan hubungan langsung dan tidak langsung dari perlakuan pestisida pada jumlah bunga, tinggi tanaman, kerusakan herbivori (y/t), dan kunjungan yang diamati (y/t) dengan masing-masing tanaman disertakan sebagai efek acak untuk memperhitungkan pengamatan berulang. Untuk membandingkan kelimpahan jamur bunga pada tingkat seluruh tanaman (lihat di atas), kami memperkirakan hubungan langsung dan tidak langsung dari perlakuan, kunjungan (dimodelkan baik sebagai jumlah total kunjungan binomial ‘dikunjungi’ dan berkelanjutan yang diamati pada tanaman itu), dan keragaman Simpson terbalik (1/ D ) pada jumlah koloni log menggunakan distribusi Gaussian. Akhirnya, untuk metrik kebugaran tingkat tanaman, kami memperkirakan hubungan langsung dan tidak langsung dari perlakuan pestisida pada kunjungan (seperti di atas), keragaman Simpson terbalik (1/ D ), dan jumlah biji dan massa biji menggunakan distribusi Gaussian. Keragaman Simpson terbalik diperkirakan untuk keluarga menggunakan paket Vegan (Oksanen et al., 2022 ).

3 HASIL
Semua sampel tanaman pra-perlakuan dan tanaman yang diobati dengan larutan kontrol tidak terdeteksi tebukonazol atau imidakloprid dalam jaringannya (Tabel S1 ). Tanaman yang diobati dengan fungisida memiliki rata-rata 3,11 μg (±1,23 SE) tebukonazol per gram jaringan daun segar, dan tidak terdeteksi imidaklprid. Tanaman yang diobati dengan insektisida memiliki rata-rata 2,54 (±1,18 SE) μg/g imidaklprid, dan tidak terdeteksi tebukonazol (tetapi perlu dicatat bahwa dua sampel hanya mengandung imidaklprid pada batas deteksi); dan tanaman yang menerima kedua perlakuan memiliki rata-rata 1,02 μg/g (±0,29 SE) tebukonazol dan 4,5 μg/g (±1,76 SE) imidaklprid (tetapi perlu dicatat bahwa satu sampel hanya mengandung imidaklprid pada batas deteksi).

3.1 Kunjungan
Kami melakukan pengamatan bunga selama 1170 menit, mencatat 215 kunjungan oleh 102 pengunjung unik dan 132 kejadian tidak ada kunjungan selama percobaan. Hasilnya adalah rata-rata 4,3 ± 0,98 kunjungan SE per tanaman. Secara total, 45,1% pengunjung terdiri dari famili Apidae (dikategorikan ke genus Ceratina 41,2%, Apis mellifera 3,9%), 27,4% adalah Halictidae , 20,6% adalah Megachilidae , 4,9% adalah Pieridae , dan 2,0% adalah Diptera .

Kami menemukan bahwa tanaman dengan lebih banyak bunga lebih mungkin dikunjungi (Gambar 2 ; Est = 0,16, Jalur p  < 0,001; kecocokan model: Fisher’s C  = 7,51, df = 4, p  = 0,11). Jumlah bunga berbeda di antara berbagai perlakuan, dan tanaman yang menerima kedua bahan kimia tersebut memiliki rata-rata 48% lebih banyak bunga daripada kontrol (Est = 0,72, Jalur p  = 0,08). Meskipun tanaman yang diobati dengan fungisida menghasilkan rata-rata 51% lebih banyak bunga daripada tanaman kontrol, efek ini diperkirakan lebih kecil dan bervariasi (Est = 0,18, Jalur p  = 0,58). Menariknya, tanaman yang diobati dengan insektisida memiliki hubungan negatif dengan jumlah bunga, menghasilkan rata-rata 65% lebih sedikit bunga daripada kontrol (Est = −0,56, Jalur p  = 0,10). Dampak tidak langsung yang diperkirakan dari perlakuan kami terhadap kunjungan, yang dimediasi oleh jumlah bunga, paling kuat pada tanaman yang menerima perlakuan kombinasi (Est = 0,12) dan lebih kecil pada perlakuan fungisida (Est = 0,03) dan insektisida (Est = −0,09). Meskipun kami mengamati dampak negatif dari perlakuan insektisida terhadap jumlah bunga, perlakuan insektisida memiliki dampak langsung yang positif terhadap kunjungan, meskipun hubungan ini juga bervariasi (Est = 0,60, Jalur p  = 0,51). Dampak langsung dari dua perlakuan kimia lainnya terhadap kunjungan cukup kecil (Fungisida: Est = 0,16, Jalur p  = 0,93; Keduanya: Est Standar = −0,03, Jalur p  = 0,86). Tinggi tanaman memiliki dampak yang dapat diabaikan terhadap kunjungan, dan meskipun adanya kerusakan herbivori memiliki dampak positif terhadap kunjungan, hubungan ini cukup bervariasi (Tabel S2 ). Demikian pula, kami tidak menemukan bukti adanya hubungan antara perlakuan dan identitas atau keanekaragaman pengunjung bunga (Tabel S2 ).

3.2 Kelimpahan Jamur Bunga
Secara keseluruhan, dampak perlakuan dan kunjungan pada kelimpahan jamur bunga (log CFU) kecil atau sangat bervariasi (Gambar S2 ; Model binomial: Fisher’s C  = 0,499, df = 4, p  = 0,97; Log CFU: χ 2  = 0,01, df = 3, p  = 1,00). Dampak terbesar yang kami amati adalah hubungan negatif antara kunjungan yang diamati (y/t), dan jamur bunga (Tabel S3 ; Estimasi Standar = -0,28, Jalur p  = 0,16), tetapi hubungan ini sangat bervariasi. Jumlah total kunjungan yang diamati hanya memiliki dampak kecil pada kelimpahan jamur (Estimasi Standar = -0,09, Jalur p  = 0,67) tetapi sekali lagi koefisien ini sangat bervariasi. Perkiraan dampak tidak langsung dari perlakuan terhadap jamur bunga, yang dimediasi oleh kunjungan, semuanya kecil dalam kasus ini (Perkiraan Fungisida = -0,04, Perkiraan Insektisida: -0,03, dan Perkiraan Keduanya: 0,01). Dampak langsung dari perlakuan kami terhadap kelimpahan jamur juga diperkirakan cukup kecil dan juga sangat bervariasi (Tabel S3 ). Keragaman pengunjung yang diamati oleh Simpson juga memiliki hubungan negatif dengan kelimpahan jamur bunga, tetapi sekali lagi perkiraan dampak dari hubungan ini bervariasi (Tabel S3 ).

3.3 Pembentukan benih
Secara keseluruhan, 50% tanaman yang berbunga menghasilkan biji. Kami menemukan bahwa jika suatu tanaman diamati telah dikunjungi setidaknya sekali (y/t), tanaman tersebut lebih mungkin menghasilkan biji (Tabel S4 ; Est Standar Jalur = 0,35, Jalur p  = 0,02; Kesesuaian model keseluruhan: Fisher’s C  = 3,46, df = 4, nilai- p = 0,484). Di antara tanaman yang kami amati dikunjungi setidaknya sekali, kami juga menemukan bukti yang jelas tentang hubungan positif antara jumlah kunjungan dan jumlah biji per buah (Est = 0,47, Jalur p  < 0,01) dan massa biji (Est = 0,29, Jalur p  = 0,10). Kami mengamati hubungan negatif antara keragaman pengunjung dan jumlah biji per buah (Est = −0,32, Jalur p  = 0,05), tetapi dampaknya pada massa biji kurang jelas (Est = 0,14, Jalur p  = 0,38).

Dampak langsung dari perlakuan kami terhadap jumlah dan massa benih besar, dan meskipun sangat bervariasi, namun hal itu menunjukkan hubungan yang menarik (Model Jumlah Benih: χ 2  = 3,46, df = 3, nilai- p = 0,246; Model Massa Benih: χ 2  = 6,04, df = 3, nilai- p = 0,11). Seperti model sebelumnya, di sini kedua model menemukan dampak langsung yang positif dari perlakuan fungisida dan perlakuan kedua bahan kimia terhadap kunjungan (Gambar 3 ; Est = 0,32 Jalur p  = 0,36 dan Est = 0,63, Jalur p  = 0,36, masing-masing; lihat Tabel S4 untuk metrik massa benih). Meskipun perlakuan fungisida dan perlakuan kedua bahan kimia tersebut memiliki dampak tidak langsung yang positif pada massa benih dan jumlah benih dengan meningkatkan kunjungan (Fungisida: Est Jumlah Benih = 0,15, Est Massa Benih = 0,09; Keduanya: Est Jumlah Benih = 0,29, Est Massa Benih = 0,18), efek tidak langsung positif ini tidak cukup besar untuk lebih besar daripada dampak negatif langsung dari perlakuan ini pada massa benih (Fungisida: Est = −0,45, Jalur p  = 0,40; Insektisida: Est = −0,23, Jalur p  = 0,61; Keduanya: Est = −0,37, Jalur p  = 0,58). Jumlah benih per buah terpengaruh secara serupa (meskipun perlakuan kedua bahan kimia tersebut diperkirakan memiliki efek positif yang kecil; Tabel S4 ). Rata-rata, tanaman yang diobati memiliki benih yang lebih sedikit dan lebih ringan daripada tanaman kontrol; Tanaman yang diobati dengan insektisida memiliki 92% lebih sedikit dan 15% lebih ringan bijinya, tanaman yang diobati dengan fungisida memiliki 45% lebih sedikit dan 23% lebih ringan bijinya, dan terakhir tanaman yang menerima kedua pengobatan tersebut memiliki 40% lebih sedikit dan 65% lebih ringan bijinya secara rata-rata. Jadi, meskipun ada dampak positif dari kunjungan pada metrik biji, dampak negatif langsung dari pengobatan kami menghasilkan lebih sedikit biji dan lebih ringan daripada yang mungkin diperkirakan sebelumnya.

4 DISKUSI
Kami meneliti apakah tanaman yang diobati dengan insektisida dan fungisida, secara terpisah dan dalam kombinasi, mengubah interaksi tanaman-penyerbuk, kelimpahan jamur bunga, dan metrik benih. Secara keseluruhan, tanaman yang memiliki lebih banyak bunga lebih mungkin dikunjungi. Kami mengamati kunjungan yang lebih tinggi pada tanaman yang menerima fungisida dan perawatan kombinasi, dimediasi oleh jumlah bunga yang lebih tinggi dalam kelompok-kelompok ini. Dampak perawatan dan kunjungan pada kelimpahan jamur bunga diperkirakan cukup bervariasi, dan tidak ada pola yang kuat muncul. Akhirnya, tanaman dengan kunjungan yang diamati lebih tinggi menghasilkan benih yang lebih banyak dan lebih berat, tetapi kami mengamati dampak langsung, negatif, dari perawatan kami pada metrik benih ini, yang meniadakan dampak positif kunjungan (meskipun hubungan ini cukup bervariasi). Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa perawatan kimia ini secara tidak langsung dapat memengaruhi kunjungan penyerbuk dengan memengaruhi jumlah bunga dan dapat memengaruhi kebugaran tanaman pada bunga liar.

4.1 Interaksi tanaman-penyerbuk
Kami menemukan bahwa tanaman dengan lebih banyak bunga lebih mungkin dikunjungi, terlepas dari perawatannya, yang tidak mengejutkan mengingat ukuran tampilan bunga merupakan faktor utama yang dipertimbangkan penyerbuk saat mencari makan (Schiestl & Johnson, 2013 ). Sebuah studi oleh Wei et al. juga menemukan bahwa perawatan fungisida merupakan prediktor kunjungan yang kurang efektif dibandingkan dengan manipulasi tampilan bunga. Jumlah bunga dapat dibatasi pada tanaman oleh alokasi sumber daya untuk pertahanan; dan karena fungisida dan insektisida dirancang untuk melindungi tanaman, peningkatan yang kami amati dalam jumlah bunga mungkin merupakan hasil dari alokasi sumber daya yang diubah (Züst & Agrawal, 2017 ). Namun, ini tidak menjelaskan mengapa kami mengamati lebih sedikit bunga pada tanaman yang dirawat dengan insektisida dibandingkan dengan tanaman kontrol. Insektisida neonikotinoid menginduksi respons terkait asam salisilat pada tanaman, yang meningkatkan pertumbuhan dan toleransi terhadap stres (Ford et al., 2010 ). Meskipun kami tidak mengamati tanaman ini menjadi lebih tinggi (Tabel S2 ), ada kemungkinan tanaman yang diobati dengan insektisida mengalokasikan lebih banyak sumber daya untuk aspek pertumbuhan lainnya yang tidak kami ukur (yaitu peningkatan panjang akar) daripada reproduksi. Menariknya, efeknya tidak dipertahankan ketika insektisida dikombinasikan dengan fungisida, dan tanaman ini memiliki bunga terbanyak dari semua perlakuan. Kemungkinan lain adalah bahwa produksi bunga lebih tinggi pada tanaman yang diobati dengan fungisida dan kombinasi sebagai respons stres (Saladin & Clément, 2005 ; Takeno, 2016 ). Banyak tanaman sebenarnya sensitif terhadap pestisida dan merespons pengenalan bahan kimia baru dengan respons stres, mengubah metabolisme dan alokasi sumber daya (Saladin & Clément, 2005 ). Dalam penelitian kami, hal ini dapat mengakibatkan jumlah bunga yang lebih tinggi sebagai upaya terakhir untuk bereproduksi. Temuan bahwa paparan pestisida dapat mengubah keseimbangan fisiologis pada bunga liar menjadi perhatian luas bagi ahli biologi konservasi, karena kontaminasi bunga liar umum terjadi pada banyak tanaman (Zioga et al., 2020 ). Kami berharap penelitian di masa mendatang mempertimbangkan mekanisme fisiologis di balik kemungkinan perubahan tersebut.

Temuan penting di sini adalah bahwa penyerbuk sama-sama mungkin mengunjungi tanaman yang diobati dan yang tidak diobati, dan dalam beberapa kasus, lebih mungkin mengunjungi tanaman yang diobati. Meskipun aplikasi tunggal bahan kimia ini pada Penstemon strictus menghasilkan konsentrasi pestisida yang lebih tinggi daripada yang biasanya terlihat pada daun tanaman liar yang bukan target (Halsch et al., 2020 ; Zioga et al., 2020 ), konsentrasi ini harus mencerminkan konsentrasi tanaman lain yang diobati langsung oleh produk ini (yaitu di kebun belakang rumah). Ini mengkhawatirkan karena bahan kimia ini dapat berdampak buruk pada kelangsungan hidup, reproduksi, dan bahkan perilaku lebah, yang dapat memiliki efek tingkat populasi yang bertahan selama beberapa generasi pasca-paparan (Cullen et al., 2019 ; Muth & Leonard, 2019 ; Stuligross & Williams, 2021 ). Satu studi bahkan menunjukkan bahwa insektisida dapat berinteraksi dengan metabolit sekunder nektar untuk memperbesar konsekuensi kesehatan negatif dari paparan pestisida (Richman et al., 2022 ). Selain itu, kombinasi insektisida dan fungisida (terutama fungisida penghambat biosintesis seperti yang dipelajari di sini) dapat memiliki dampak negatif yang sinergis pada kesehatan lebah (Raimets et al., 2018 ; Schuhmann et al., 2022 ).

Namun, penyerbuk tertentu dapat menghindari paparan. Sebuah studi yang menanyakan apakah milkweed yang dirawat mengubah oviposisi kupu-kupu raja dan preferensi makan larva menemukan bahwa campuran insektisida, fungisida, dan herbisida menghalangi oviposisi pada milkweed, tetapi tidak memengaruhi preferensi ulat (Olaya-Arenas et al., 2020 ). Para penulis menduga ini adalah hasil dari sistem kemosensori yang sangat terspesialisasi dari raja betina yang mendeteksi perbedaan kimia pada milkweed yang dirawat. Kurangnya kapasitas kemosensori yang sama terspesialisasinya mungkin menjelaskan mengapa penyerbuk dalam studi kami tidak terhalang oleh tanaman yang dirawat. Meskipun demikian, kami menunjukkan bahwa penyerbuk tidak menghindari tanaman yang dapat memiliki konsekuensi kesehatan yang negatif.

4.2 Jamur bunga
Dalam percobaan kami, kami tidak menemukan bukti kuat mengenai dampak pengobatan terhadap kelimpahan jamur bunga. Untuk insektisida, hal ini mungkin diharapkan mengingat dampak neonicotinoid pada jamur bunga dapat bergantung pada konsentrasi (Cecala & Vannette, 2024 ). Namun, fungisida telah terbukti mengubah komposisi komunitas jamur nektar, berdampak negatif pada keanekaragaman jamur bunga, dan mengurangi kelimpahan jamur tertentu baik pada tanaman pangan maupun bunga liar (Bartlewicz et al., 2016 ; Schaeffer et al., 2017 , 2020 ; Wei et al., 2021 ).

Mungkin ada beberapa alasan mengapa kami tidak mengamati pengurangan yang diharapkan pada jamur bunga di sini. Kualitas dan kuantitas nektar dapat berfungsi sebagai penyaring habitat bagi mikroba bunga (Keller et al., 2021 ; Mueller et al., 2023 ), jadi mungkin saja pengenalan awal bahan kimia berfungsi sebagai penyaring habitat, yang untuk sementara mengurangi kelimpahan dan keanekaragaman taksa jamur. Namun, seiring berjalannya waktu, jamur yang beradaptasi lebih baik dengan lingkungan yang kaya pestisida mungkin telah berkembang biak, sehingga tidak ada perbedaan yang dapat diamati dalam kelimpahan ketika kami mengambil sampel tanaman 5 minggu setelah perawatan awal. Jika ini terjadi, kami mungkin telah mengamati perubahan dalam komposisi komunitas jamur, yang tidak dapat kami pertimbangkan dalam penelitian ini. Kemungkinan lain adalah bahwa kunjungan yang lebih tinggi yang diamati pada tanaman yang diobati dengan fungisida meningkatkan kolonisasi, mengurangi dampak langsung negatif dari bahan kimia pertanian pada kelimpahan jamur bunga (Vannette, 2020 ; Wei et al., 2021 ). Kami juga melihat beberapa bukti bahwa kunjungan dapat menurunkan jamur bunga (meskipun hubungan ini tidak kuat), yang mungkin merupakan hasil dari kunjungan tinggi yang menghabiskan sumber daya bunga yang berfungsi sebagai substrat untuk jamur (Keller et al., 2021 ). Akhirnya, jumlah CFU memberikan perkiraan kasar dari kelimpahan jamur, karena jamur hujan harus dapat dikultur dan karena itu mungkin tidak mencerminkan kelimpahan atau keanekaragaman sampel yang sebenarnya. Dalam studi ini, kami mengandalkan CFU karena kendala biaya. Namun, studi seperti Wei et al., yang menggunakan teknik yang lebih maju seperti qPCR atau pengurutan ITS jamur, telah berhasil mendeteksi efek pengobatan. Mengingat keterbatasan ini, kami mendesak kehati-hatian dalam menafsirkan temuan ini dan mendorong studi masa depan untuk bekerja untuk memisahkan dinamika kolonisasi dan kompetisi yang tidak dapat kami jelajahi di sini.

4.3 Kebugaran tanaman
Kami menemukan bahwa kemungkinan produksi benih, serta massa benih dan jumlah benih, ditingkatkan dengan kunjungan. Ini konsisten dengan studi rumah kaca Penstemon strictus (dan spesies Penstemon lainnya ), meskipun tidak dianggap terbatas pada serbuk sari di lapangan (Castellanos et al., 2003 ; Parachnowitsch & Kessler, 2010 ). Oleh karena itu, sangat mengejutkan bahwa tanaman yang dirawat (terutama tanaman yang dirawat dengan fungisida dan ganda yang menerima kunjungan terbanyak) tidak menghasilkan benih yang lebih berat. Meskipun fungisida dan perawatan kombinasi memiliki dampak tidak langsung yang positif pada metrik benih dengan menarik pengunjung, kami menemukan dampak langsung yang negatif (namun bervariasi) dari perawatan pada metrik benih. Sekali lagi, meskipun hubungan ini diperkirakan dengan kesalahan yang cukup besar, mereka menunjukkan potensi hubungan biologis penting yang menjamin eksplorasi lebih lanjut. Hubungan langsung yang negatif menyiratkan bahwa perawatan mungkin memiliki dampak fisiologis yang mengurangi kebugaran tanaman. Studi tentang aplikasi fungisida dan insektisida sering melaporkan peningkatan hasil panen pada tanaman pangan, khususnya ketika diaplikasikan saat ada hama atau patogen (Milosavljević et al., 2019 ; Rothrock et al., 2012 ; Swoboda & Pedersen, 2009 ; Tamburini et al., 2021 ). Akan tetapi, Penstemon sp. biasanya memiliki konsentrasi tinggi bahan kimia defensif lainnya (misalnya glikosida iridoid; Kelly & Bowers, 2017 ) dan dengan demikian mungkin tidak melihat manfaat hasil panen dari aplikasi pestisida. Sebaliknya, jika paparan pestisida benar-benar membuat tanaman kita stres (seperti yang disebutkan sebelumnya), berkurangnya mobilisasi metabolit primer dapat mengubah trade-off dalam investasi antara massa benih dan jumlah benih yang dialami tanaman (Notarnicola et al., 2023 ; Paul-Victor & Turnbull, 2009 ; Saladin & Clément, 2005 ) atau trade-off investasi antara massa benih dan pengisian nektar pada tingkat kunjungan yang lebih tinggi, yang diusulkan oleh Ornelas dan Lara ( 2009 ) dalam spesies Penstemon yang berbeda .

Di luar perubahan fisiologi tanaman, massa biji yang lebih rendah dari yang diharapkan pada tanaman yang menerima kunjungan tinggi dapat disebabkan oleh efek langsung bahan kimia pertanian pada pengunjung bunga. Misalnya, konsumsi nektar yang dicampur bahan kimia pertanian mungkin telah mengubah waktu penanganan bunga lebah atau perilaku lain yang memengaruhi pemindahan serbuk sari. Satu studi menemukan bahwa lebah yang terpapar neonicotinoid mengumpulkan lebih banyak serbuk sari, tetapi memiliki waktu penanganan bunga yang lebih lama, dan lebih menyukai spesies tanaman yang berbeda daripada lebah kontrol (Stanley & Raine, 2016 ). Ketidakcocokan yang kami temukan antara tingkat kunjungan dan metrik biji menunjukkan bahwa bahan kimia pertanian, dalam beberapa kasus, dapat memiliki efek hilir pada kebugaran tanaman. Namun, mekanisme spesifik atau kombinasi mekanisme di balik efek ini masih agak sulit dipahami.

5 KESIMPULAN
Poin penting dari studi ini adalah bahwa penyerbuk liar akan mengunjungi bunga liar yang dirawat secara kimia sesering, jika tidak lebih sering daripada, tanaman yang tidak dirawat. Bahan kimia pertanian telah ada di mana-mana di lanskap pertanian dan non-pertanian, tetapi tampaknya penyerbuk tidak akan menghindarinya bahkan jika diberi pilihan. Dengan mengubah sifat tanaman yang relevan bagi penyerbuk, bahan kimia ini dapat memikat penyerbuk ke dalam perangkap ekologi, di mana mereka tidak terhalang oleh tanaman yang sebenarnya berbahaya (Hale & Swearer, 2016 ). Ketika digunakan dengan tepat pada tanaman pangan, insektisida dan fungisida menangkal pengurangan pertahanan alami yang berasal dari domestikasi (Grout et al., 2021 ; Whitehead et al., 2017 ). Tanaman non-pangan yang belum melihat tekanan seleksi ini mungkin tidak mendapatkan manfaat dari aplikasi kimia.

Di sini, kami mengamati potensi dampak hilir pada kebugaran tanaman dengan ketidakcocokan antara metrik benih dan kunjungan pada tanaman yang diobati dengan bahan kimia pertanian, dan mengingat hal ini, berbagai taksa tanaman mungkin berisiko mengalami konsekuensi kebugaran saat terpapar bahan kimia pertanian. Kami menganjurkan penelitian di masa depan untuk memeriksa bagaimana pestisida mengubah dinamika trade-off fisiologis pada tanaman non-tanaman. Selain itu, ko-formulan atau bahan tidak aktif dalam pestisida semakin dikenal dampaknya terhadap lebah (Mullin, 2015 ; Straw et al., 2022 ). Meskipun kami tidak dapat memisahkan dampak bahan aktif dan tidak aktif pada fisiologi tanaman dalam penelitian kami, bahan tersebut mungkin berperan, dan mengurai efek ini tetap menjadi tujuan penting untuk bergerak maju. Secara lebih luas, kami mencatat bahwa penelitian tentang efek ekologis bahan kimia pertanian sering kali mengabaikan bunga liar dan tanaman non-tanaman. Di tengah upaya lembaga nirlaba dan lembaga untuk mendukung penanaman penyerbuk dalam skala kecil dan besar, memahami bagaimana dan mengapa tanaman ini terdampak oleh paparan pestisida merupakan bagian penting yang hingga saat ini masih belum terungkap. Temuan kami memajukan pemahaman ini dengan menunjukkan bahwa pada satu spesies umum, dampak tersebut mungkin cukup kompleks, dan terwujud dalam berbagai komponen kebugaran yang berbeda.