Abstrak
LATAR BELAKANG
Ekstrak kulit biji kakao (CBS) telah muncul sebagai sumber senyawa antimikroba yang menjanjikan. Akan tetapi, senyawa bioaktif yang bertanggung jawab atas aktivitas antimikrobanya belum diteliti secara memadai. Penelitian ini menganalisis sifat antimikroba dari 12 ekstrak dari CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi, menggunakan teknik ekstraksi distilasi pelarut dan uap untuk memaksimalkan keragaman bioaktif. Ekstrak tersebut dinilai terhadap bakteri dan jamur tertentu, termasuk patogen ‘ESKAPE’.
HASIL
Pelarut CBS dan ekstrak distilasi uap (kecuali CBS yang difermentasi dengan etil asetat) ditemukan menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Streptococcus mutans dengan konsentrasi hambat minimum (MIC) serendah 0,0625 mg mL −1 , sedangkan ekstrak CBS distilasi uap yang difermentasi dan tidak difermentasi ditemukan aktif terhadap Candida albicans dengan MIC pada 1 mg mL −1 . Secara keseluruhan, ekstrak distilasi uap memiliki aktivitas antimikroba yang ditingkatkan dibandingkan dengan ekstrak pelarut CBS. Ekstrak CBS yang difermentasi ditemukan memiliki aktivitas antimikroba yang lebih baik daripada ekstrak CBS yang tidak difermentasi. Analisis metabolomik mengidentifikasi teobromin (TB) dan tetrametilpirazina (TMP) sebagai molekul yang berkontribusi terhadap aktivitas antimikroba terhadap S. mutans . Hasil penelitian menunjukkan bahwa kafein (CAF), TB dan TMP aktif terhadap S. mutans dan Acinetobacter baumannii , sedangkan CAF dan TB aktif terhadap C. albicans . Efek sinergis yang signifikan dari CAF, TB, dan TMP dengan ciprofloxacin (CIP) diamati terhadap Klebsiella aerogenes.
KESIMPULAN
Temuan ini menyoroti potensi signifikan senyawa bioaktif yang ada dalam CBS untuk digunakan dalam pengembangan agen antimikroba berkelanjutan. Senyawa alami ini, termasuk CAF, TB, dan TMP, menunjukkan sifat antimikroba yang penting, yang juga dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan aktivitas antibiotik yang umum digunakan seperti siprofloksasin. Penelitian selanjutnya dapat difokuskan pada penentuan cara kerja molekul bioaktif ini. © 2025 Penulis. Jurnal Ilmu Pangan dan Pertanian diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Society of Chemical Industry.
PERKENALAN
Resistensi multiobat antimikroba (AMR) merupakan masalah kesehatan global yang mendesak dan diperburuk oleh penggunaan antibiotik yang berlebihan dan salah di berbagai sektor, termasuk kedokteran, pertanian, peternakan, dan akuakultur.1 Meskipun pengembangan antibiotik baru sangat penting untuk memerangi AMR, semakin sulit untuk membawa antibiotik baru ke pasaran, terutama karena tingginya biaya yang dikeluarkan dan keluarnya perusahaan farmasi besar dari bidang ini.
Didorong oleh gagasan untuk menurunkan biaya penemuan obat antibiotik serta pengelolaan limbah pertanian dan makanan yang berkelanjutan, limbah dari produk alami sering kali dieksplorasi karena potensi antimikrobanya. Telah terbukti berulang kali menawarkan alternatif yang menjanjikan untuk penemuan obat konvensional dengan memanfaatkan keragaman kimia yang ditemukan dalam sumber daya yang kurang dimanfaatkan ini. 2 – 7
Malaysia adalah salah satu pedagang kakao terbesar di Asia dan menghasilkan limbah kakao yang substansial selama pemrosesan industri. 8 Limbah kakao menimbulkan tantangan lingkungan, yang mendorong para peneliti untuk mengeksplorasi cara-cara untuk menggunakannya kembali untuk penggunaan yang bermanfaat. Salah satu jalan adalah untuk mengeksplorasi potensi pengobatannya karena limbah ini diketahui kaya akan senyawa bioaktif seperti polifenol, metilxantin, dan lipid (Gbr. 1 ). Kulit biji kakao (CBS) adalah salah satu produk sampingan utama. Ini mewakili sekitar 10% hingga 17% dari total berat biji dan dikeluarkan dari kotiledon sebelum atau setelah proses pemanggangan. 9 Laporan awal dalam beberapa tahun terakhir telah menyoroti sifat antidiabetik, 10 antioksidan, 11 antimikroba, 12 – 15 dan anti-inflamasi 16 – 18 dari CBS. Temuan positif mengenai aktivitas antimikrobanya mendorong penyelidikan ini ke dalam potensinya.
Fermentasi biji kakao merupakan langkah umum dalam pengolahan kakao. Proses ini memengaruhi kandungan fenolik, protein, dan lemak kakao. 19 – 21 Sejauh pengetahuan penulis penelitian saat ini, penelitian tentang perbandingan aktivitas antimikroba ekstrak CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi belum dilaporkan.
Studi ini menganalisis senyawa bioaktif yang terdapat dalam CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi menggunakan berbagai protokol ekstraksi. Aktivitas antimikroba dari ekstrak ini dievaluasi terhadap bakteri gram positif dan gram negatif termasuk patogen ‘ESKAPE’, dan Candida albicans . Setiap ekstrak CBS menunjukkan kandungan senyawa bioaktif yang bervariasi. Analisis metabolomik juga dilakukan untuk menyelidiki hubungan antara profil bioaktif ekstrak CBS dan kemampuan antimikrobanya, serta untuk mengidentifikasi senyawa kunci yang terkait dengan aktivitas penghambatannya. Senyawa bioaktif CBS terpilih dievaluasi lebih lanjut untuk aktivitas antimikroba dan efek sinergisnya dengan siprofloksasin.
BAHAN DAN METODE
CBS kering yang difermentasi dan tidak difermentasi diperoleh dari Dewan Kakao Malaysia (Nilai, Negeri Sembilan, Malaysia). CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi disiapkan mengikuti metode yang dijelaskan dalam literatur. 22 , 23 Secara singkat, biji kakao segar (100 g) difermentasi pada suhu kamar selama 5 hari, diikuti oleh fermentasi kedua selama 5 hari dengan penambahan air suling (60 mL). Pengelupasan kulit dilakukan melalui mikronisasi inframerah pada 130 °C selama 2 menit pada 600 rpm. Biji kemudian dipecah menggunakan pemecah biji, dan kulit dipisahkan dari biji dengan penampi. CBS yang tidak difermentasi dikupas menggunakan protokol yang sama, menghilangkan langkah-langkah fermentasi.
Ekstraksi pelarut CBS terfermentasi dan CBS non-fermentasi
Ekstraksi CBS dilakukan menurut laporan sebelumnya dengan sedikit modifikasi. 24 , 25 Sampel dihilangkan lemaknya sebelum prosedur ekstraksi. Singkatnya, CBS bubuk (50 g) ditambahkan ke heksana (250 mL) dan campuran diaduk selama 5 menit. Setelah diaduk, campuran disaring vakum dan proses diulang dua kali. Sampel yang dihilangkan lemaknya dikeringkan dalam oven pada suhu 50 °C selama 4 jam. Lima pelarut berbeda digunakan: etil asetat, etanol, metanol, etanol-air yang diasamkan (pH 3, 80:20 v/v), dan metanol-air yang diasamkan (pH 3, 80:20 v/v). pH disesuaikan menggunakan asam klorida 0,1 mol L −1 . Ekstraksi pelarut dilakukan menggunakan sistem refluks. Kulit biji kakao (5 g) ditambahkan ke setiap pelarut ekstraksi (15 mL) dan direfluks selama 60 menit sambil diaduk. Setiap pelarut dipanaskan hingga titik didihnya atau sedikit di atasnya: etil asetat dan etanol pada suhu 78 °C, metanol pada suhu 65 °C, etanol-air yang diasamkan pada suhu 80 °C, dan metanol-air yang diasamkan pada suhu 70 °C. Setelah didinginkan hingga suhu kamar, filtrat dikumpulkan. Proses ekstraksi diulang dua kali, dan filtrat yang dikumpulkan kemudian digabungkan dan selanjutnya dikeringkan dalam vakum untuk menghasilkan ekstrak akhir.
Distilasi uap
Kulit biji kakao (60 g) dan air suling (600 mL) dicampur dalam labu alas bulat. Campuran dipanaskan hingga mendidih di atas mantel pemanas selama 1,5 jam. Sekitar 100 mL distilat ditampung dalam labu penerima. Setelah distilat diekstraksi dengan diklorometana (DCM) (150 mL × 3), pelarut organik dihilangkan dalam vakum untuk memperoleh fraksi ekstrak sulingan uap.
Kromatografi cair–spektrometri massa waktu terbang kuadrupol
Data kromatografi cair–spektrometri massa waktu terbang kuadrupol (LC-QTOF-MS) diambil menggunakan sistem LC Agilent 1290 Infinity yang digabungkan dengan spektrometer massa waktu terbang kuadrupol (QTOF) Agilent 6520 Accurate-Mass (Agilent, Santa Clara, CA, AS). Pemisahan kromatografi dicapai menggunakan kolom Agilent Eclipse XDB-C18 (150 mm × 2,1 mm, Agilent). Fase mobil terdiri dari 0,1% asam format dalam air: 0,1% asam format dalam asetonitril, diaplikasikan dalam gradien dari 95:5 (0–5 menit) hingga 0:100 (5–20 menit), diikuti oleh elusi isokratik pada 0:100 (20–25 menit), pada laju alir 0,5 mL menit −1 . Data diperoleh menggunakan perangkat lunak analisis kualitatif Agilent MassHunter B.07.00. Mode ionisasi positif dan negatif digunakan. Metabolit sekunder diidentifikasi dengan membandingkannya dengan basis data METLIN; senyawa dengan skor kecocokan di bawah 80% tidak disertakan dalam analisis lebih lanjut.
Kromatografi gas–spektrometri massa
Sistem kromatografi gas–spektrometri massa QP2010 Ultra (Shimadzu, Kyoto, Jepang) dilengkapi dengan kolom Zebron ZB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) dengan ketebalan film dan suhu maksimum 350 °C. Helium dengan kemurnian sangat tinggi (99,99%) digunakan sebagai gas pembawa pada laju aliran konstan 1,0 mL/menit. Suhu injeksi, jalur transfer, dan sumber ion semuanya diatur pada 280 °C. Suhu oven diprogram untuk mulai pada 80 °C (selama 2 menit) dan ditingkatkan menjadi 280 °C pada laju 3°C/menit. Ekstrak kasar diencerkan dengan pelarut yang sesuai (1/100, v/v), disaring, dan 1 μL ekstrak yang diencerkan disuntikkan dengan rasio split 10:1. Spektrum massa pemindaian penuh dikumpulkan pada rentang pemindaian 40–550 sma. Komposisi persentase konstituen ekstrak mentah ditentukan oleh persentase luas puncak, dengan senyawa kimia diidentifikasi berdasarkan waktu retensi kromatografi gas (GC) dan dicocokkan dengan pustaka spektrum massa NIST 08.
Analisis statistik
Analisis statistik dari studi metabolomik yang tidak ditargetkan dilakukan menggunakan modul satu faktor di MetaboAnalyst 6.0. 26 Dataset dinormalisasi jumlah, ditransformasikan log, dan diskalakan Pareto untuk menilai varians dalam aktivitas antimikroba terhadap Streptococcus mutans (aktif, cukup aktif, kurang aktif, dan tidak aktif) dalam ekstrak CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi menggunakan analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA). Analisis komponen utama, analisis multivariat tanpa pengawasan, menggunakan lima komponen untuk memvisualisasikan pengelompokan sampel berdasarkan profil metabolik. Analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial, metode yang diawasi, digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan yang signifikan dalam metabolit yang diekstraksi dari ekstrak CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi. Validasi model dengan pengujian permutasi menghasilkan P < 0,01, dan validasi silang lima kali lipat digunakan untuk memperkirakan kesalahan prediksi dan menghitung nilai Q 2 dan R 2 untuk lima komponen. Analisis komponen utama dan PLS-DA tidak dilakukan pada ekstrak CBS yang disuling dengan uap (F-SD dan NF-SD) karena keterbatasan data. Skor variabel penting dalam proyeksi (VIP) dihitung untuk mengidentifikasi metabolit yang berkontribusi terhadap pemisahan dalam plot PLS-DA; skor VIP lebih besar dari 1 menunjukkan metabolit yang sangat membedakan antara sampel aktif dan tidak aktif. Peta panas juga dibuat untuk memvisualisasikan konsentrasi metabolit di seluruh ekstrak CBS.
Protokol umum untuk uji aktivitas antimikroba
Uji mikrodilusi kaldu
Uji mikrodilusi kaldu dilakukan menurut pedoman Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 27 Semua strain bakteri dikultur pada agar Mueller–Hinton (MHA), kecuali S. mutans , yang dikultur pada agar trypticase soy (TSA), dan C. albicans , yang dikultur pada agar dekstrosa kentang. Setelah 24 jam inkubasi, koloni dipindahkan ke dalam kaldu masing-masing dan diinkubasi selama 24 jam lagi pada suhu 37 °C. Suspensi keruh yang dihasilkan kemudian disesuaikan dengan standar McFarland 0,5 yang mengandung 1 × 106 CFU mL −1 . Setelah inokulasi, pelat 96 sumur diinkubasi pada suhu 37 °C selama 18 jam. Konsentrasi penghambatan minimum (MIC) ditentukan secara visual sebagai konsentrasi terendah di mana tidak ada pertumbuhan yang terlihat diamati. Ciprofloxacin (CIP) dan cycloheximide berperan sebagai kontrol positif untuk strain bakteri dan C. albicans . Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
Studi sinergis senyawa fenolik CIP dari limbah CBS
Efek sinergis antara CIP dan senyawa yang berasal dari limbah CBS dievaluasi terhadap berbagai mikroorganisme, termasuk Staphylococcus aureus yang resistan terhadap methicillin (MRSA) ATCC 33591; S. aureus yang rentan terhadap methicillin (MSSA) ATCC 25923 dan ATCC 6538; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031; Enterococcus faecalis ATCC 29212; E. faecium ATCC 700221; Bacillus cereus ATCC 14579; Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145; Acinetobacter baumannii ATCC BAA-1605 (resisten terhadap banyak obat); strain A. baumannii C28, C65, dan C98 (diisolasi dari Rumah Sakit Segamat, Johor, Malaysia); 28 Escherichia coli ATCC 10798; S. mutans ATCC 25175; B. subtilis ATCC 8188; K. aerogenes ATCC 13048; dan C. albicans ATCC 10231.
Efek sinergis dari CIP yang dikombinasikan dengan senyawa bioaktif theobromine (TB), kafein (CAF), dan tetramethylpyrazine (TMP) yang ada di CBS dievaluasi menggunakan metode pengenceran papan catur dengan modifikasi kecil. 29 Semua senyawa diuji untuk efek sinergisnya pada konsentrasi maksimum dalam pelarut yang berbeda. Theobromine dilarutkan dalam 0,5 mol L −1 air NaOH, CAF dilarutkan dalam kaldu Mueller–Hinton (MHB), dan TMP dilarutkan dalam metanol. Setiap pelarut diuji terhadap bakteri dan jamur yang sesuai untuk memastikan bahwa itu tidak berkontribusi pada pembunuhan pada konsentrasi akhirnya. Pengenceran serial senyawa CBS dalam kombinasi dengan CIP dicampur dalam MHB. Inokulasi disiapkan dari koloni yang tumbuh semalam pada MHA, kecuali untuk S. mutans , yang tumbuh dalam agar kedelai triptikase (TSA) dan C. albicans , yang tumbuh dalam agar dekstrosa kentang (PDA). Efek sinergis ditentukan setelah inkubasi pada suhu 37 °C selama 18 jam. Setiap percobaan diulang tiga kali. Interaksi in vitro antara senyawa CBS dan CIP diukur dengan menentukan indeks konsentrasi penghambatan fraksional (FICI) menggunakan Persamaan (1). FICI setiap senyawa diinterpretasikan sebagai berikut: FICI 0,5 atau kurang menunjukkan sinergi; FICI antara 0,5 dan 1 menunjukkan aditivitas; FICI antara 1 dan 2 menunjukkan tidak ada efek, dan FICI lebih besar dari 2 menunjukkan antagonisme .
di mana X = konsentrasi TB, CAF, atau TMP.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini menyelidiki komposisi fitokimia dan aktivitas antimikroba dari ekstrak kulit biji kakao (CBS) yang difermentasi dan tidak difermentasi. Dua belas ekstrak CBS yang difermentasi (F) dan tidak difermentasi (NF) diperoleh dari ekstraksi pelarut menggunakan etil asetat (F-EtOAc, NF-EtOAc), etanol yang diasamkan (FA-EtOH, NF-A-EtOH), etanol (F-EtOH, NF-EtOH), metanol yang diasamkan (FA-MeOH, NF-A-MeOH), metanol (F-MeOH, NF-MeOH), dan distilasi uap (F-SD, NF-SD). Kandungan fitokimia non-volatil dari ekstrak pelarut ditentukan oleh LC-QTOF-MS dan kandungan volatil dari distilasi uap dianalisis menggunakan kromatografi gas–spektrometri massa (GC–MS).
Analisis Fitokimia Non-volatil dan Volatil dari Ekstrak CBS Fermentasi dan Non-Fermentasi
Sebanyak 50 senyawa diusulkan dari analisis LC-QTOF-MS dari ekstrak pelarut CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi. Senyawa yang tidak mudah menguap dan intensitas puncak volumenya dari ekstrak yang difermentasi (F-EtOAc, FA-EtOH, F-EtOH, FA-MeOH dan F-MeOH) dan ekstrak yang tidak difermentasi (NF-EtOAc, NF-A-EtOH, NF-EtOH, NF-A-MeOH dan NF-MeOH) dirangkum dalam Informasi Pendukung, Tabel S1 , dan digambarkan dalam Gambar S1 , dan metabolit dalam setiap ekstrak diilustrasikan dalam peta panas dalam Gambar 2 . Secara umum, senyawa utama yang ditemukan dalam ekstrak pelarut yang difermentasi dan tidak difermentasi adalah metilxantin (TB, CAF) dan polifenol (proantosianidin, turunan katekin, dan turunan kafeoil) dan berbagai macam lipid (sfinganin, oleamida, dan N -pentadecylcyclohexanecarboxamide), dengan ekstrak yang tidak difermentasi menunjukkan lebih banyak keanekaragaman daripada CBS yang difermentasi. Konsentrasi TB dan CAF yang lebih tinggi ditemukan dalam ekstrak CBS yang difermentasi. Temuan ini sejalan dengan hasil, di mana CBS yang tidak difermentasi menunjukkan lebih sedikit kandungan TB dan CAF karena eksudasi dari biji ke kulit setelah fermentasi. 19 , 31 – 34
Empat puluh enam senyawa volatil terdeteksi dari analisis GC–MS dari ekstrak distilasi uap CBS yang difermentasi (F-SD) dan tidak difermentasi (NF-SD). Sebagian besar senyawa yang terdeteksi adalah lipid, dengan ekstrak yang tidak difermentasi mengandung lebih banyak lipid daripada CBS yang difermentasi. Informasi Pendukung, Tabel S2 berisi daftar senyawa volatil yang ditemukan dalam F-SD dan NF-SD. Senyawa-senyawa tersebut digambarkan dalam Informasi Pendukung, Gambar S2 . Perlu dicatat bahwa TMP hanya ditemukan dalam CBS yang difermentasi (F-SD).
Studi ini memberikan wawasan berharga mengenai komposisi fitokimia dari CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi yang diidentifikasi dengan analisis LC-QTOF-MS dan GC–MS. Namun, tidak adanya konfirmasi struktural dari spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) atau data analitis lebih lanjut membatasi analisis senyawa yang lebih konklusif.
Aktivitas Antimikroba Ekstrak CBS Fermentasi dan Non-Fermentasi
Aktivitas antimikroba dari ekstrak dinilai terhadap panel bakteri dan jamur seperti yang diuraikan dalam Informasi Pendukung, Tabel S3 . Hasil penelitian mengungkapkan bahwa tidak ada ekstrak yang menunjukkan penghambatan bakteri pada konsentrasi 2 mg mL −1 atau lebih rendah, kecuali untuk S. mutans dan C. albicans (Tabel 1 ). Selain F-EtOAc, semua ekstrak CBS menunjukkan penghambatan terhadap S. mutans , dengan MIC berkisar dari 0,0625 hingga 2 mg mL −1 . Baik ekstrak distilasi uap yang difermentasi dan tidak difermentasi menunjukkan penghambatan yang signifikan terhadap C. albicans , dengan MIC 1 mg mL −1 . Beberapa penelitian telah menyelidiki aktivitas antimikroba dari ekstrak yang berasal dari biji kakao, kulit buah kakao dan CBS, dengan sebagian besar kasus melaporkan nilai MIC yang lebih tinggi. Dilaporkan bahwa ekstrak bubuk kakao menunjukkan MIC 5 mg/mL terhadap C. albicans, E. coli, S. aureus , dan P. aeruginosa , sementara C. albicans merupakan mikroorganisme paling sensitif dengan MIC terendah 5 mg mL −1 . 35 Mereka juga menemukan bahwa ekstrak bubuk kakao memiliki potensi sedikit lebih tinggi terhadap bakteri gram positif daripada bakteri gram negatif. Satu studi menemukan bahwa ekstrak air-metanol sekam kakao mentah menghambat S. choleraesuis dan S. epidermidis dengan konsentrasi penghambatan minimum (MIC) masing-masing 1 mg mL −1 dan 2,5 mg mL −1 . 36 Studi lain juga menunjukkan aktivitas antimikroba dari ekstrak etanol-air CBS terhadap S. mutans , dengan MIC serendah 0,0625 μg·mL −1 . Namun, tidak ada aktivitas yang diamati terhadap MSSA, MRSA, E. coli , P. aeruginosa , C. albicans , atau S. cerevisiae . 12
| Contoh ID | Konsentrasi penghambatan minimum (MIC) (mg mL −1 ) | |
|---|---|---|
| S.mutans (ATCC 25175) | C. albicans (ATCC 10231) | |
| F-EtOAc | >2 | >2 |
| FA-EtOH | 2 | >2 |
| F-EtOH | 0.5 | >2 |
| FA-MeOH | 0.5 | >2 |
| F-MeOH | 0.5 | >2 |
| F-SD | 0,0625 pukul 0,0625 | 1 |
| NF-EtOAc | 1 | >2 |
| NF-A-EtOH | 1 | >2 |
| NF-EtOH | 2 | >2 |
| NF-A-MeOH | 1 | >2 |
| NF-MeOH | 1 | >2 |
| NF SD | 0,125 | 1 |
| Siprofloksasin (CIP) | 1 μg ml -1 | 0,156 μg ml −1 |
| Sikloheksimid (CHX) | – | 0,0625 μg ml -1 |
Analisis komparatif antara ekstrak pelarut yang difermentasi dan tidak difermentasi mengungkapkan bahwa ekstrak CBS yang difermentasi menunjukkan aktivitas antimikroba yang sedikit lebih baik daripada ekstrak CBS yang tidak difermentasi terhadap S. mutans . Ekstraksi pelarut ekstrak CBS yang difermentasi, FA-EtOH, F-EtOH, FA-MeOH, dan F-MeOH menunjukkan MIC yang lebih rendah sebesar 0,5 mg mL −1 terhadap S. mutans daripada ekstrak yang tidak difermentasi, NF-EtOAc, NF-A-EtOH, NF-EtOH, NF-A-MeOH dan NF-MeOH, yang memiliki MIC sebesar 1 mg mL −1 . Literatur sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak kakao yang tidak difermentasi sering kali menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih unggul karena keragaman fitokimia yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak kakao yang difermentasi. Studi-studi ini difokuskan pada perbandingan aktivitas antimikroba dari ekstrak biji kakao yang difermentasi dan tidak difermentasi, bukan ekstrak CBS . melaporkan bahwa ekstrak biji kakao yang tidak difermentasi dengan MIC 4 mg mL −1 menunjukkan aktivitas antibakteri yang sedikit lebih baik terhadap S. mutans daripada kakao yang difermentasi, yang memiliki MIC 8 mg mL −1 . 37 Selain itu, ekstrak biji kakao yang tidak difermentasi dilaporkan menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih baik terhadap Porphyromonas gingivalis daripada kakao yang difermentasi. 38 Sebaliknya, temuan penelitian saat ini menunjukkan bahwa ekstrak CBS yang difermentasi menunjukkan aktivitas penghambatan yang lebih besar terhadap S. mutans daripada ekstrak CBS yang tidak difermentasi. Peningkatan aktivitas tersebut mungkin disebabkan oleh kadar TB dan CAF yang lebih tinggi yang terdapat dalam ekstrak yang difermentasi dibandingkan dengan ekstrak CBS yang tidak difermentasi.
Penelitian sebelumnya tentang CBS hanya berfokus pada penggunaan pelarut organik sebagai ekstraktan. Tujuan dari penelitian saat ini adalah untuk menyelidiki potensi antimikroba dari distilat uap CBS, suatu metode yang belum pernah dilaporkan. Dalam penelitian ini, ekstrak distilasi uap, yang mengandung fitokimia volatil, menunjukkan aktivitas antimikroba tiga kali lebih besar daripada sampel yang diekstraksi dengan pelarut. Ekstrak CBS distilasi uap yang difermentasi juga menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih unggul terhadap S. mutans dibandingkan dengan ekstrak yang tidak difermentasi (MIC F-SD: 0,0625 μg mL −1 ; MIC NF-SD: 0,125 μg mL −1 ).
Identifikasi Senyawa Kunci Penghambatan S. mutans
Sangat penting untuk memahami fitokimia spesifik yang bertanggung jawab atas peningkatan aktivitas antimikroba dari ekstrak CBS yang difermentasi untuk mengevaluasi potensi terapeutiknya. Untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang menghambat S. mutans , komposisi fitokimia ekstrak CBS dianalisis menggunakan LC-QTOF-MS dan GC–MS. Ekstrak F-EtOAc yang tidak aktif dibandingkan dengan ekstrak yang difermentasi dan tidak difermentasi secara aktif menggunakan MetaboAnalyst. PCA tanpa pengawasan dan PLS-DA dengan pengawasan dilakukan (Gbr. 3(a),(b) , masing-masing) untuk mengklasifikasikan senyawa bioaktif yang tidak mudah menguap berdasarkan profil metabolitnya. Analisis komponen utama, yang tidak menunjukkan pemisahan kelompok yang jelas, menjelaskan 76% dari total varians di lima komponen: PC1 (25,4%), PC2 (14,9%), PC3 (13,4%), PC4 (11,3%), dan PC5 (10,7%). Sebaliknya, PLS-DA mengungkapkan pemisahan senyawa non-volatil di antara semua ekstrak, dengan PC1 (11,5%), PC2 (17,2%), PC3 (16,7%), PC4 (8,8%), dan PC5 (7,8%) yang mencakup total varians sebesar 62%. Temuan ini menunjukkan bahwa model tersebut secara efektif membedakan metabolit yang terkait dengan berbagai tingkat aktivitas (aktif, cukup aktif, kurang aktif, dan tidak aktif) dalam ekstrak pelarut yang difermentasi dan tidak difermentasi. Analisis komponen utama dan analisis PLS-DA senyawa volatil dari ekstrak distilasi uap CBS (F-SD dan NF-SD) tidak dilakukan karena kumpulan data terbatas, yang hanya terdiri dari dua kategori: sangat aktif dan kurang aktif.
Nilai variabel penting dalam proyeksi (VIP), berdasarkan model PLS-DA senyawa volatil dan nonvolatil, dilaporkan dalam Gambar 4(a),(b) . Ini memperkirakan pentingnya setiap metabolit dalam model PLS. Dalam penelitian ini, asam 16-hidroksi heksadekanoat, yang hanya diamati dalam ekstrak CBS F-EtOH, FA-MeOH dan F-MeOH, merupakan metabolit paling signifikan dan mungkin terkait dengan penghambatan S. mutans . Namun, tidak ada penelitian sebelumnya yang melaporkan asam 16-hidroksi heksadekanoat (asam juniperat) yang memiliki aktivitas antimikroba terhadap S. mutans atau patogen lainnya. Meskipun demikian, senyawa yang terkait secara struktural seperti asam palmitat, asam stearat, asam laurat, asam kaprilat, dan asam 3-hidroksiundecanoat semuanya telah menunjukkan sifat antimikroba. 39 – 42 Validasi eksperimental lebih lanjut dengan demikian diperlukan untuk menilai signifikansinya secara akurat.
Berdasarkan skor VIP untuk senyawa volatil, TMP, yang hanya ada dalam F-SD berpotensi menjadi salah satu metabolit penting yang menghambat S. mutans . Tetramethylpyrazine telah dilaporkan memiliki efek anti-inflamasi dan anti-kanker. 43 – 46 Sementara banyak penelitian telah melaporkan berbagai aktivitas biologis TMP, hanya penelitian terbatas yang menyelidiki analog TMP terhadap S. aureus , B. subtilis , S. agalactiae , dan E. coli . 47 – 49 Selain itu, aktivitas antibakteri TMP terhadap S. mutans belum pernah dilaporkan sebelumnya. Dalam penelitian ini, TMP sendiri menunjukkan aktivitas terhadap S. mutans dengan MIC 1,5 mg mL −1 yang 24 kali lipat lebih tinggi daripada MIC ekstrak distilasi uap (F-SD, MIC: 0,0625 mg mL −1 ), yang menunjukkan efek sinergis TMP dengan senyawa lain dalam ekstrak F-SD.
Aktivitas antibakteri yang lebih lemah dari ekstrak NF-SD terhadap S. mutans mungkin disebabkan oleh tidak adanya TMP. NF-SD mengandung lebih banyak ester asam lemak dan lebih sedikit asam lemak bebas, yang diketahui memiliki sifat antibakteri yang lebih kuat, dan ini mungkin juga menjadi salah satu alasan penghambatannya yang lebih lemah terhadap S. mutans . Studi menunjukkan bahwa esterifikasi asam lemak cenderung mengurangi aktivitas antibakteri, kecuali untuk bentuk sukrosa yang diesterifikasi. 50 Studi ini menemukan bahwa ekstrak NF-SD terutama mengandung ester asam lemak termetilasi dan termetilasi dengan lebih sedikit asam lemak bebas daripada F-SD.
Perbandingan metabolit sekunder utama (TB dan CAF) dalam limbah CBS menunjukkan bahwa hanya TB yang secara signifikan meningkatkan aktivitas terhadap S. mutans . Khususnya, TB menunjukkan kadar yang substansial di antara berbagai ekstrak, dengan tingkat penemuan palsu (FDR) lebih rendah dari 0,05, yang menunjukkan signifikansinya terhadap aktivitas antimikroba. Ini konsisten dengan hasil di mana TB (MIC: 1,25 mg mL −1 ) menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih baik terhadap S. mutans daripada CAF (MIC: 4 mg mL −1 ), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Studi juga telah menunjukkan efek antimikroba TB terhadap bakteri yang berhubungan dengan karies, seperti S. mutans dan Actinomyces naeslundii , dan bakteri yang tidak berhubungan dengan karies seperti Lactobacillus acidophilus dan E. faecalis . 51 , 52
| Contoh ID | Konsentrasi penghambatan minimum (mg mL −1 ) | |||
|---|---|---|---|---|
| S.mutans (ATCC 25175) | C. albicans (ATCC 10231) | A. baumannii (ATCC BAA 1605) | A. baumannii (C65) | |
| TBC | 1.25 | 0,625 | >1.25 | 1.25 |
| Bahasa CAF | 4 | 4 | 2 | 2 |
| TMP | 1.5 | >1.5 | 1.5 | >1.5 |
| Bahasa Indonesia: CIP | 1 μg ml -1 | 0,156 μg ml −1 | >1 μg ml −1 | 0,256 μg ml −1 |
| CHX . | – | 0,0625 μg ml -1 | – | – |
Singkatan: TB, teobromin; TMP, tetrametilpirazina; CAF, kafein; CIP, siprofloksasin, CHX, sikloheksimid.
Kafein, TB dan TMP menunjukkan aktivitas terhadap A. baumannii , dengan MIC masing-masing 2, 1,25 dan 1,5 mg mL −1 (Tabel 2 ). Meskipun CAF telah dilaporkan aktif terhadap A. baumannii pada 4 mg mL −1 , aktivitas terhadap A. baumannii oleh TB dan TMP belum pernah dilaporkan sebelumnya. 53 Dengan demikian, hasil dari penelitian ini menunjukkan potensi antimikroba dari CAF, TB dan TMP. Potensi sinergis mereka dengan CIP terhadap berbagai patogen dibahas di bagian berikutnya.
Efek sinergis
Tujuan dari studi aktivitas sinergis adalah untuk menilai aktivitas antimikroba dari senyawa bioaktif umum dalam CBS seperti TB, CAF, dan TMP terhadap beberapa mikroba, sendiri atau dikombinasikan dengan CIP. Ciprofloxacin, antibiotik yang umum diresepkan, dipilih untuk studi sinergis karena aktivitas antimikroba spektrum luasnya. Namun, resistensi terhadap CIP merupakan masalah yang berkembang, yang menjadikannya kandidat ideal untuk studi sinergis, karena menggabungkannya dengan senyawa bioaktif lain seperti CAF, TB, dan TMP berpotensi membantu memulihkan efektivitasnya, mengurangi dosis yang dibutuhkan, dan berpotensi menunda perkembangan resistensi. Efek sinergis TB, CAF, dan TMP yang dikombinasikan dengan CIP ditentukan oleh FICI yang diperoleh dari metode sinergisme papan catur. Efek sinergis ini ditentukan terhadap berbagai bakteri dan jamur, termasuk patogen ‘ESKAPE’, B. cereus, E. faecalis, B. subtilis, S. mutans, E. coli , dan C. albicans seperti yang diuraikan dalam Tabel 3 .
| Bakteri | Konsentrasi penghambatan minimum (MIC) | Indeks konsentrasi penghambatan fraksional (FICI) | Efek kombinasi | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Bioaktif CBS mg mL −1 | CIP μg ml -1 | Campuran μg mL −1 | ||||
| Penyakit MRSA | TBC | >1.25 | 0.5 | 0.5 | 1.00 | Pengabaian |
| Nomor ATCC 33591 | Bahasa CAF | 16 | >0.5 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.5 | 1.00 | Pengabaian | ||
| MSSA | TBC | >1.25 | 0,004 tahun | 0,004 tahun | 1.00 | Pengabaian |
| Nomor ATCC 25923 | Bahasa CAF | 16 | 0,004 tahun | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0,004 tahun | 1.00 | Pengabaian | ||
| MSSA | TBC | >1.25 | 0,002 | 0,002 | 1.00 | Pengabaian |
| 6538 | Bahasa CAF | 16 | 0,002 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0,002 | 1.00 | Pengabaian | ||
| K. pneumonia | TBC | >1.25 | 0.256 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian |
| ATCC 10031 | Bahasa CAF | 8 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.512 | 2.00 | Pengabaian | ||
| Bakteri E.faecalis | TBC | >1.25 | 1 | 1 | 1.00 | Pengabaian |
| Nomor ATCC 29212 | Bahasa CAF | 8 | 1 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 1 | 1.00 | Pengabaian | ||
| E.faecium sp. | TBC | >1.25 | 0,032 | 0,032 | 1.00 | Pengabaian |
| ATCC 700221 | Bahasa CAF | 4 | 0,032 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | 1.5 | 0,032 | 1.00 | Pengabaian | ||
| Bakteri albicans | TBC | 0,625 | Bahasa Indonesia: CHX | 0,625 | 1.00 | Pengabaian |
| 10 231 | Bahasa CAF | 4 | 0,625 | 0,625 | 1.00 | Pengabaian |
| TMP | >1.5 | 0.313 | 0,50 | Sinergi | ||
| B. cereus | TBC | >1.25 | 0.128 | 0.256 | 2.00 | Pengabaian |
| Nomor ATCC 14579 | Bahasa CAF | 8 | 0.256 | 2.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.256 | 2.00 | Pengabaian | ||
| Bakteri P.aeruginosa | TBC | >1.25 | 0.256 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian |
| ATCC 10145 | Bahasa CAF | >16 | 0.128 | 0,50 | Sinergi | |
| TMP | >1.5 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | ||
| A. baumanni | TBC | >1.25 | >0.512 | >0.512 | 1.00 | Pengabaian |
| BAA 1605 | Bahasa CAF | 2 | >0.512 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | 1.5 | >0.512 | 1.00 | Pengabaian | ||
| A. baumanni | TBC | 1.25 | 0.256 | >0.512 | 2.00 | Pengabaian |
| Bahasa Indonesia: C65 | Bahasa CAF | 2 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | ||
| A. baumanni | TBC | >1.25 | 0.128 | 0.128 | 1.00 | Pengabaian |
| C28 | Bahasa CAF | 2 | 0.128 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.128 | 1.00 | Pengabaian | ||
| A. baumanni | TBC | >1.25 | 0.256 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian |
| Bahasa Indonesia: C98 | Bahasa CAF | 4 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | ||
| Bakteri E.coli | TBC | >1.25 | 0,016 | 0,016 | 1.00 | Pengabaian |
| Nomor ATCC 10798 | Bahasa CAF | 4 | 0,016 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0,016 | 1.00 | Pengabaian | ||
| S.mutans adalah bakteri yang menyerang sistem saraf pusat dan saraf tepi. | TBC | 1.25 | 1 | 1 | 1.00 | Pengabaian |
| ATCC 25175 | Bahasa CAF | 4 | 1 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | 1.5 | 1 | 1.00 | Pengabaian | ||
| B. subtilis | TBC | 1.25 | 0.256 | 0,125 | 0.48 | Sinergi |
| ATCC 8188 | Bahasa CAF | 16 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | |
| TMP | >1.5 | 0.256 | 1.00 | Pengabaian | ||
| K. aerogenes | TBC | 1.25 | 0.5 | 0,0625 pukul 0,0625 | 0.31 | Sinergi |
| Nomor ATCC 13048 | Bahasa CAF | 16 | 0,0625 pukul 0,0625 | 0,25 | Sinergi | |
| TMP | >1.5 | 0,125 | 0.38 | Sinergi | ||
Singkatan: TB, teobromin; TMP, tetrametilpirazina; CAF, kafein; CIP, siprofloksasin; CBS, kulit biji kakao; MSSA, S. aureus yang rentan terhadap methicillin; MRSA, S. aureus yang resistan terhadap methicillin.
Beberapa hubungan sinergis ditemukan antara CIP/CHX dan senyawa umum yang ditemukan dalam limbah CBS. Menarik untuk dicatat bahwa efek sinergis diamati ketika CIP dikombinasikan dengan ketiga metabolit yang diuji yang ditemukan dalam CBS (TB, CAF, dan TMP) terhadap K. aerogenes . Temuan ini penting karena K. aerogenes adalah salah satu patogen yang paling ganas dan telah menunjukkan resistensi terhadap beberapa antibiotik.
Demikian pula, sinergi diamati antara TMP dan CHX terhadap C. albicans , dan antara CAF dan CIP terhadap P. aeruginosa . Theobromine dan CIP juga menunjukkan efek sinergis positif terhadap B. subtilis . Mekanisme yang mendasari interaksi ini belum dipahami dan hal ini memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
KESIMPULAN
Baik ekstrak CBS yang difermentasi maupun yang tidak difermentasi ditemukan menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap S. mutans dan C. albicans dengan ekstrak yang difermentasi menunjukkan aktivitas yang lebih baik. Ekstrak yang disuling dengan uap juga menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih baik daripada ekstrak pelarut. Dengan menggunakan pendekatan metabolomik, TMP diidentifikasi sebagai agen antibakteri potensial terhadap S. mutans . Hasilnya menunjukkan bahwa komposisi ester asam lemak dan asam lemak bebas berdampak signifikan terhadap kemanjuran antimikroba. Aktivitas antibakteri yang lebih kuat dari ekstrak distilasi uap yang difermentasi dapat dikaitkan dengan kandungan asam lemak bebas yang lebih tinggi, dengan lebih sedikit asam lemak termetilasi dan termetilasi. Efek sinergis positif juga diamati ketika CAF, TB, dan TMP dikombinasikan dengan CIP terhadap K. aerogenes tetapi tetap acuh tak acuh terhadap sebagian besar strain bakteri dan jamur lain yang diuji. Sinergi juga diamati ketika TMP dikombinasikan dengan CHX terhadap C. albicans . Kafein dan CIP juga bekerja secara sinergis melawan P. aeruginosa sementara TB dan CIP juga menunjukkan sinergi positif melawan B. subtilis .
Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan interaksi kompleks berbagai metabolit yang ditemukan dalam ekstrak CBS yang difermentasi dan tidak difermentasi serta kontribusinya terhadap aktivitas antimikroba. Meskipun beberapa senyawa bioaktif utama telah diidentifikasi, kurangnya konfirmasi struktural melalui spektroskopi NMR atau data analitis lebih lanjut membatasi analisis yang lebih konklusif terhadap senyawa yang diusulkan. Mekanisme aksinya juga masih belum jelas. Dengan demikian, penelitian di masa mendatang dapat difokuskan pada analisis metabolik atau enzimatik yang ditargetkan untuk menjelaskan cara kerja molekul bioaktif ini.
