ABSTRAK
Infeksi dengan salmon gill poxvirus (SGPV) dapat menyebabkan patologi insang yang parah, yang menyebabkan gangguan pernapasan dan tingkat kematian yang tinggi di tempat penetasan salmon, yang dikenal sebagai penyakit salmon gill poxvirus. Sementara infeksi telah didokumentasikan pada salmon di laut, induk ikan dan salmon liar, kejadiannya pada salmon alevin masih belum dilaporkan. Studi ini menyajikan empat uji coba yang bertujuan untuk menginfeksi salmon alevin dengan SGPV, dengan fokus pada variasi dalam kondisi penyimpanan, pemrosesan bahan infeksius dan kohabitasi. Dengan memanfaatkan hibridisasi in situ RNAscope dan teknik PCR, kami menunjukkan bahwa sel epitel di insang, rongga mulut dan kulit salmon alevin Atlantik memang dapat terinfeksi SGPV. Selain itu, temuan kami mengungkapkan bahwa menyimpan bahan tantangan pada suhu -20°C membahayakan infeksi virus. Sebaliknya, pengawetan pada suhu -80°C mempertahankan infeksi, bahkan dalam supernatan insang terinfeksi yang dihomogenkan.
1 Pendahuluan
Poxvirus adalah virus DNA berselubung besar dan kompleks dengan genom untai ganda yang menginfeksi berbagai macam hewan. Namun untuk teleost, infeksi poxvirus sejauh ini hanya dikenali pada spesies yang penting secara komersial seperti salmon Atlantik (Gjessing et al., 2015 , 2017 ), ikan mas (Ono et al. 1986 ) dan baru-baru ini juga ikan kod Atlantik (Gjessing, Tengs, Nilsen, Mohammad & Weli, 2025 ). Salmon gill poxvirus (SGPV) termasuk dalam sub-famili Chordopoxvirus (ChPV), dengan ukuran 360 × 270 × 250 nm dan genom lebih dari 240 kb (Gjessing et al., 2015 ). Virus ini menginfeksi sel epitel insang salmon Atlantik ( Salmo salar L.) (selanjutnya disebut salmon) dan dapat menyebabkan patologi insang parah yang menyebabkan penyakit salmon gill poxvirus (SGPVD). Mikroskop elektron transmisi sel epitel insang dari salmon yang menderita SGPVD pertama kali mengidentifikasi salmon gill poxvirus pada tahun 2008 (Nylund et al. 2008 ). Kemudian, genom virus lengkap diurutkan pada tahun 2015 (Gjessing et al., 2015 ) yang memungkinkan pengembangan alat diagnostik, termasuk uji qPCR, antibodi untuk imunohistokimia (Gjessing et al., 2015 ) dan hibridisasi in situ RNA scope (Thoen et al. 2020 ).
Penggunaan metode ini telah menunjukkan bahwa SGPV tersebar luas di antara salmon Atlantik di wilayah Atlantik timur laut. Virus ini telah diidentifikasi tidak hanya di beberapa tempat penetasan air tawar, tetapi juga di peternakan laut, peternakan induk ikan, dan populasi salmon liar (Gjessing et al., 2017 ; Garseth et al. 2018 ; Gulla et al. 2020 ). Di tempat penetasan, wabah SGPVD dapat menyebabkan kematian akut yang tinggi pada salmon muda yang mengalami gangguan pernapasan yang disebabkan oleh apoptosis ekstensif sel epitel insang (Gjessing et al. 2015 , 2017 , 2018 ) dan terkadang eritrofagositosis yang parah (Gjessing et al. 2015 , 2020 ). Wabah yang parah ini biasanya didahului oleh peristiwa yang membuat stres dan telah dikonfirmasi secara eksperimental (Thoen et al. 2020 ). Infeksi SGPV subklinis dengan viral load rendah sering terjadi dan infeksi SGPV pada salmon di laut sering terlihat dalam kombinasi dengan patogen lain (Gjessing et al., 2021 ) yang terkadang berperan dalam penyakit insang yang kompleks (Gjessing et al., 2021 ). Namun, karena wabah yang sangat parah sesekali di tempat penetasan salmon, SGPV dianggap sebagai patogen yang signifikan dan ditakuti dalam industri budidaya salmon. Baik penyakit insang secara umum maupun SGPVD bukanlah penyakit yang dapat dilaporkan, sehingga sulit untuk melacak secara akurat jumlah kasus tahunan dan tingkat kematian terkait virus di tempat penetasan salmon. Namun, skrining ekstensif telah mengonfirmasi keberadaan SGPV di Norwegia, Skotlandia, dan Kepulauan Faroe (Gjessing et al., 2018 ; Gulla et al. 2020 ), dan dalam penelitian ini, juga di Islandia.
Karena kurangnya sistem kultur SGPV, tantangan infeksi eksperimental diperlukan, menggunakan jaringan yang terinfeksi SGPV sebagai bahan tantangan. Dalam penelitian sebelumnya (Thoen et al. 2020 ), seluruh salmon yang menderita SGPVD di-eutanasia dan dikirim semalaman di atas es ke fasilitas penelitian, yang berfungsi sebagai bahan tantangan. Temuan dari penelitian tersebut mengonfirmasi bahwa stres, yang ditiru oleh kortisol, dalam kombinasi dengan infeksi SGPV, memicu manifestasi SGPVD yang parah. Namun, kondisi penyimpanan jaringan yang terinfeksi SGPV untuk infeksi eksperimental dapat memengaruhi infektivitas virus (data yang tidak dipublikasikan). Karena model infeksi yang akurat dan dapat direproduksi sangat penting dalam penelitian penyakit menular, penelitian ini menyelidiki efek suhu penyimpanan dan homogenisasi jaringan pada hasil infeksi. Selain itu, karena infeksi SGPV pada alevin salmon belum didokumentasikan, tujuan kami adalah untuk menentukan apakah tahap perkembangan ini dapat terinfeksi dan mengevaluasi potensinya sebagai model eksperimental untuk penelitian SGPV. Mendemonstrasikan kerentanan alevin terhadap SGPV dapat memungkinkan penggunaannya sebagai sumber penularan virus yang berkelanjutan untuk uji coba infeksi sel in vitro yang berhasil. Lebih jauh, penelitian kami tentang respons imun pra-smolt salmon terhadap SGPV menunjukkan bahwa ikan yang bertahan hidup dari infeksi SGPV eksperimental dapat menunjukkan kerentanan yang berkurang terhadap paparan virus berikutnya (data yang tidak dipublikasikan). Menetapkan model infeksi SGPV pada alevin juga akan memfasilitasi penelitian tentang kinetika infeksi virus dan tingkat kematian pada alevin yang diberi virus selama tahap perkembangan selanjutnya.
Studi ini menyajikan laporan pertama infeksi SGPV pada ikan salmon Atlantik, yang menunjukkan sel epitel yang apoptotik dan terinfeksi SGPV pada insang, kulit, dan rongga mulut. Kami menyoroti pentingnya menyimpan bahan uji untuk percobaan SGPV pada suhu -80°C untuk memastikan hasil yang sukses dalam uji coba uji. Selain itu, kami menekankan manfaat penggunaan bahan uji yang dihomogenkan untuk meningkatkan keandalan percobaan.
2 Bahan dan Metode
2.1 Hewan Percobaan dan Prosedur Pengambilan Sampel
Alevin salmon Atlantik (560–630 derajat-hari) diperoleh dari Universitas Ilmu Hayati Norwegia. Karena Otoritas Keamanan Pangan Eropa dan Otoritas Keamanan Pangan Norwegia tidak memerlukan persetujuan untuk eksperimen yang melibatkan alevin (Otoritas Keamanan Pangan Norwegia 2024 ; Kementerian Pertanian dan Pangan Norwegia 2015 ), tidak ada aplikasi Forsøksdyrforvatningen tilsyns- og søknadssystem yang diajukan untuk eksperimen yang dilakukan dalam studi ini. Alevin di-eutanasia dengan overdosis benzocaine (≈400 mg/L) (Benzoak vet, EuroPharma, Norwegia) sebelum pengambilan sampel dan diawetkan dalam formalin buffer 10% (Chemi-Teknik AS, Oslo, Norwegia) untuk histopatologi dan hibridisasi in situ. Alevin untuk analisis qPCR dan RT-qPCR diawetkan dalam tabung mikrocentrifuge yang berisi 1 mL RNAlater (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AM7021). Karena ukurannya kecil, seluruh alevin diawetkan, dan kepalanya kemudian dipotong dan dianalisis.
2.2 Materi Tantangan
Dalam penelitian ini, ikan salmon yang menderita SGPVD dari tiga fasilitas berbeda (lokasi 1–3) digunakan sebagai bahan tantangan (CM1—CM3). Bahan tantangan 1 (CM1) dan 2 (CM2) diambil sampelnya dari dua fasilitas salmon Norwegia, dengan berat masing-masing sekitar 160 g per ikan dan 180 g per ekor. CM3 diperoleh dari fasilitas Islandia, dengan berat sekitar 6 g per ikan. Ikan yang sakit dieutanasia dan dikirim dalam keadaan beku semalaman ke fasilitas penelitian dan disimpan seperti yang dijelaskan selanjutnya. Bahan tantangan juga dievaluasi untuk memastikannya bebas dari patogen insang lainnya sebagai bagian dari rutinitas diagnostik di Institut Kedokteran Hewan Norwegia (NVI).
2.3 Tantangan Eksperimen
Dari Desember 2021 hingga Juni 2023, empat eksperimen tantangan SGPV dilakukan untuk menginfeksi ikan salmon Atlantik dengan SGPV. Gambaran umum desain eksperimen ditunjukkan
2.4 Percobaan 1: Alevins Terpapar Bahan Baru yang Terinfeksi SGPV
Dalam percobaan tantangan SGPV yang dipublikasikan pada tahun 2020 (Thoen et al. 2020 ), salmon utuh yang diperoleh dari wabah SGPVD dikirim di atas es semalaman dan digunakan sebagai bahan tantangan saat tiba, yaitu, tanpa pembekuan. Untuk menilai apakah insang yang terinfeksi SGPV juga dapat berfungsi sebagai bahan tantangan, alevin diekspos ke seluruh salmon yang terinfeksi dan insang yang dibedah dari salmon yang terinfeksi SGPV. Sebanyak 60 alevin (630 derajat-hari) dipindahkan ke dua wadah 2-L pada suhu 4,8°C dengan 30 alevin di masing-masing wadah. Satu ikan utuh yang terinfeksi SGPV dari CM1 (SGPV Ct; 21,8) dengan berat sekitar 160 g dipindahkan ke wadah 1, sementara alevin dalam wadah 2 diekspos ke insang terinfeksi yang dibedah dari satu salmon dari CM1 (SGPV Ct; 20,2). Setelah 24 jam, bahan tantangan disingkirkan, dan air di kedua wadah diganti. Alevin diambil sampelnya pada hari ke-4, ke-12, dan ke-25 pasca-paparan (DPE) untuk qPCR, histopatologi, dan hibridisasi in situ.
2.5 Percobaan 2: Alevins Terpapar Bahan yang Terinfeksi SGPV yang Disimpan pada Suhu − 20°C
Penyimpanan CM SGPV pada suhu -20°C diduga memiliki dampak negatif pada daya infeksi SGPV pada smolt (data tidak ditampilkan). Untuk menyelidiki hal ini lebih lanjut, kami menjalankan uji coba lain menggunakan CM1 yang disimpan pada suhu -20°C dan untuk menyingkirkan kemungkinan tidak adanya stres sebagai penjelasan potensial untuk hasil negatif (stres terbukti menjadi faktor kunci dalam induksi eksperimental SGPVD; Thoen et al. 2020 ), alevin dalam Eksperimen 2 diekspos ke tiga pemicu stres yang berbeda. Sebanyak 480 alevin salmon Atlantik (600 derajat-hari) dibagi ke dalam enam wadah 2-L dengan masing-masing wadah berisi 80 alevin. Alevin diaklimatisasi selama 3 hari pada suhu 6,5°C, dengan aerator mempertahankan kadar O2 rata-rata pada 10 mg/L. Seluruh insang CM1 disimpan pada suhu -20°C selama 3 bulan (nilai Ct SGPV setelah penyimpanan adalah 23,0) dan digunakan dalam percobaan ini. Sebelum terpapar CM1, 100 ng/L hidrokortison (Solu-Cortef, Kat. No. 52240) ditambahkan ke wadah 1. Dalam wadah 2, kadar O2 diturunkan dari 10 mg/L menjadi 5,3 mg/L dengan menghilangkan aliran udara dan 2/3 air, sedangkan dalam wadah 3, suhu air dinaikkan dari 6,5°C menjadi 20°C. Kadar O2 dan suhu wadah dalam percobaan ini ditunjukkan pada Gambar SS1 . Kondisi dipertahankan selama 5 jam sebelum pemicu stres dihilangkan (yaitu, mengganti air dalam wadah 1, meningkatkan kadar O2 dalam wadah 2 dan menurunkan suhu air menjadi 6,5°C dalam wadah 3), dan alevin dalam wadah 1–4 dipaparkan ke bahan tantangan. Untuk paparan virus, delapan lengkungan insang dari satu ikan SGPV-positif sekitar 160 g dipotong menjadi dua bagian dan dibagi rata di antara keempat wadah. Bahan tantangan dihilangkan setelah 24 jam, dan alevin dalam wadah 1–3 dipaparkan kembali ke pemicu stres seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk menjamin stres ikan sebelum dan setelah paparan virus. Wadah 5 dan 6 berfungsi sebagai kontrol negatif, masing-masing berisi bahan insang bebas virus dan tidak ada bahan tantangan. Lima alevin dari setiap kelompok diambil sampelnya 3 jam setelah paparan stres pertama, setelah 27 jam dan 8 hari pasca paparan stres pertama untuk qPCR dan RT-qPCR.
2.6 Percobaan 3A: Alevin Terpapar Bahan yang Terinfeksi SGPV yang Disimpan pada Berbagai Suhu Beku
Kami juga membandingkan daya infeksi SGPV pada CM yang disimpan pada suhu yang berbeda dan untuk periode waktu yang berbeda. Untuk tujuan ini, sejumlah total 300 alevin (560 derajat-hari) dimasukkan ke dalam enam labu Erlenmeyer 1 L (50 ikan di setiap labu) yang disimpan pada suhu 6°C. Alevin dalam labu 1 dan 2 diekspos ke insang yang dibedah dari CM1 ( n = 8) dan CM2 ( n = 3) yang disimpan pada suhu -20°C selama lebih dari 1 tahun dan memiliki nilai median Ct SGPV masing-masing sebesar 23,7 (kisaran 21,8–24,5) dan 23,0 (kisaran 22,1–24,4). CM3 dikirim dari wabah SGPVD ke fasilitas penelitian semalam di atas es, dan dari 12 ikan ini, insang dengan nilai Ct SGPV median 22,0 (kisaran 20,9–24,4) dibedah dan dibagi menjadi tiga bagian yang sama. Sementara bagian pertama tetap tidak beku dan dipindahkan langsung ke labu 3, bagian kedua dan ketiga disimpan pada suhu − 80°C semalam. Keesokan harinya, bagian kedua dipindahkan ke alevin dalam labu 4, dan bagian ketiga dicairkan perlahan dengan memindahkannya ke suhu − 40°C selama 6 jam, kemudian ke suhu − 20°C semalam dan akhirnya ke suhu 4°C selama 3 jam dan kemudian dipindahkan ke labu 5. Labu 6 berfungsi sebagai kontrol negatif. Setelah 24 jam, bahan tantangan dikeluarkan dari semua labu, dan air diganti. Tujuh alevin diambil sampelnya pada hari ke-7 dan ke-13 pasca-paparan untuk pekerjaan qPCR, histopatologi, dan hibridisasi in situ.
2.7 Percobaan 3B: Kohabitasi Alevin yang naif dan terinfeksi SGPV
Alevin yang terinfeksi SGPV dan yang tidak terinfeksi dari Percobaan 3a digunakan untuk menyelidiki apakah SGPV dapat ditularkan secara eksperimental dari shedder ke alevin naif melalui kohabitasi. Untuk tujuan ini, delapan alevin yang terpapar bahan CM3 yang dicairkan dengan lembut dalam labu 5 dalam percobaan 3a dikohabitasi dengan 12 alevin di masing-masing wadah 1 dan wadah 2 dalam percobaan 3a (sebelumnya terpapar CM1 dan CM2, masing-masing, dan terbukti negatif untuk SGPV pada 13 DPE). Alevin dikohabitasi selama 12 hari dan kemudian dianalisis untuk SGPV menggunakan qPCR. Untuk memverifikasi bahwa SGPV ditransfer dari alevin yang terinfeksi dan bukan dari paparan CM1 dan CM2 sebelumnya dalam percobaan 3b, analisis multi-locus variable-number tandem-repeat (VNTR) (MLVA) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Gulla et al. 2020 ) pada semua sampel. Singkatnya, untuk ini, DNA yang diekstrak dari setiap sampel digunakan sebagai templat dalam PCR multipleks yang menampilkan delapan pasang primer (termasuk satu primer berlabel fluoresensi per pasang), dengan elektroforesis kapiler berikutnya untuk penentuan ukuran produk PCR dan perhitungan silico dari delapan profil MLVA lokus. Pohon rentang minimum berdasarkan hasil MLVA dibuat dalam BioNumerics v7.6 (Applied Maths NV, Sint-Martens-Latem, Belgia).
2.8 Percobaan4: Alevin yang Terpapar pada Bahan Terinfeksi SGPV Homogen yang Disimpan pada Suhu − 80°C
Kami menilai apakah insang ikan salmon yang terinfeksi SGPV masih infektif setelah pembekuan, homogenisasi, dan sentrifugasi. Selain itu, kami menyelidiki efek pembaruan air secara terus-menerus (10 L/jam dalam ember 12 L) terhadap perjalanan infeksi dan beban virus.
Untuk tujuan ini, insang dikeluarkan dari 13 salmon Atlantik dari CM3 (rata-rata SGPV Ct 22,2; kisaran 20,8–23,8) yang telah disimpan pada suhu -80°C selama 6 bulan. Saat masih setengah beku, keempat lengkungan insang di sisi kiri semua ikan dikeluarkan dan ditambahkan ke labu Erlenmeyer (1 L) yang berisi alevins ( n = 75, 600 derajat-hari; labu 1). Keempat lengkungan insang di sisi kanan dipindahkan ke media L15 dingin 15 mL dan dihomogenkan dengan Stomacher selama 2 menit. Kemudian, homogenat dijernihkan dengan sentrifugasi pada suhu 4°C selama 5 menit pada kecepatan 1200 rpm, dan 10 mL homogenat yang dijernihkan ditambahkan ke dalam labu Erlenmeyer kedua yang berisi alevin ( n = 75, 600 derajat-hari; labu 2). Alevin disimpan dalam dua labu pada suhu 7°C selama 24 jam dan dipindahkan ke dalam dua ember 12-L dengan sistem aliran-melalui; yaitu, alevin dari labu 1 dan 2 ke ember 1 dan 2, masing-masing. Alevin dalam ember 3 dan 4 berfungsi sebagai kontrol negatif dan masing-masing terpapar pada bahan insang bebas virus yang utuh dan homogen selama 24 jam. Enam alevin diambil sampelnya tepat setelah bahan tantangan dihilangkan, setelah 24 jam, 8 hari dan 15 hari pasca-paparan untuk pekerjaan qPCR dan histopatologi.
2.9 Ekstraksi DNA dan qPCR
DNA diekstraksi dari kepala alevin menggunakan MagNA Pure 96 dan instrumen otomatis berthroughput tinggi MagNA Pure 24 (Roche, Swiss), mengikuti Protokol Universal Patogen milik produsen. Untuk ekstraksi, kepala dari alevin dimasukkan ke dalam buffer lisis jaringan MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue lysis 500 μL (Roche, Swiss). Kepala dihomogenisasi menggunakan manik baja 5 mm dengan TissueLyser II (Qiagen, Jerman) pada 23 Hz selama 2 × 5 menit. Setelah ekstraksi DNA, spektrofotometer Multiskan SkyHigh Microplate (Thermo Fisher Scientific, AS) digunakan untuk memperkirakan kemurnian DNA dengan menghitung pengukuran rasio absorbansi A260 dan A280, memastikan rasionya ≥ 1,8. Konsentrasi DNA dihitung dengan mengalikan absorbansi pada 260 nm dengan faktor 50, dan akhirnya, semua sampel dinormalisasi ke konsentrasi 50 ng/μl.
SGPV-qPCR yang menargetkan gen D13L (Gjessing et al. 2015 ) dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Thoen et al. ( 2020 )) menggunakan Sistem Deteksi PCR Real-Time CFX384 Touch (Bio-Rad Laboratories, AS). Setiap sampel DNA dianalisis dalam duplikat menggunakan input DNA standar 100 ng (2 μL dari 50 ng/μl) dalam total volume reaksi 10 μL per sumur, dengan konsentrasi primer akhir 0,4 μM, probe pada 0,1 μM, MgCl2 pada 1,5 mM, 1,6 μL air bebas nuklease dan 5 μL UDG platinum supermix (Thermo Fisher Scientific, AS). Kondisi siklus termal berikut digunakan: 50°C selama 2 menit, 95°C selama 15 menit, diikuti oleh 45 siklus 94°C selama 15 detik, 55°C selama 30 detik, dan 72°C selama 15 detik. Nilai ambang siklus (Ct) ≥ 40 dianggap negatif.
2.10 Ekstraksi RNA dan Analisis Ekspresi Gen
Total RNA dari kepala alevin diekstraksi pada instrumen MagNA Pure 96 (Roche, Swiss) dengan MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit (Roche, Swiss), menggunakan protokol RNA seluler standar RNA tissue FF dengan volume elusi 50 μL per sampel. Hasil dan kemurnian RNA ditentukan oleh spektrofotometer Multiskan SkyHigh (Thermo Fisher Scientific, AS). Kemurnian RNA diperkirakan dengan menghitung pengukuran rasio absorbansi A260 dan A280, memastikan rasionya ≥ 2,0. Konsentrasi DNA dihitung dengan mengalikan absorbansi pada 260 nm dengan faktor 40, dan akhirnya, semua sampel dinormalisasi ke konsentrasi 100 ng/μl. cDNA disintesis menggunakan QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Jerman) yang memanfaatkan 1 μg total RNA dengan eliminasi gDNA sesuai dengan rekomendasi produsen, menghasilkan 20 μL cDNA.
Kami menggunakan RT-qPCR untuk mempelajari ekspresi gen yang terkait dengan stres, termasuk gen CYP3A (Arukwe 2005 ), GR (Chalmers et al. 2018 ), HSP70 (Olsvik et al. 2014 ), P450scc (Arukwe 2005 ), dan StAR (Arukwe 2005 ). Faktor elongasi 1α (EF1α) (Amundsen et al. 2021 ) digunakan sebagai gen housekeeping. Informasi primer diberikan dalam Tabel SS1 . RT-qPCR dilakukan menggunakan Sistem Deteksi PCR Real-Time Sentuh CFX384 (Laboratorium Bio-Rad, AS). Setiap sampel dianalisis dalam duplikasi menggunakan input cDNA standar 5 ng (2 μL dari 2,5 ng/μl) dalam volume reaksi total 10 μL per sumur dengan primer pada 10 μM, 2 μL air dan 5 μL 2xSsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, AS). Kondisi termosiklus berikut digunakan: denaturasi awal (30 detik pada 95°C) diikuti oleh 40 siklus denaturasi (15 detik pada 95°C) dan annealing/ekstensi (30 detik pada 60°C). Kurva peleburan dibuat dengan mengukur fluoresensi selama rentang suhu 55°C–95°C untuk mengonfirmasi spesifisitas amplikon akhir, dan tidak ada kontrol reverse transcriptase (NRT) dan kontrol tanpa templat (H 2 O) yang digunakan sebagai kontrol negatif. Data RT-qPCR dianalisis menggunakan Perangkat Lunak CFX Manager versi 3.1.1517.0823 (Bio-Rad Laboratories, AS). Tingkat ambang siklus ekspresi dinormalisasi ke gen referensi EF1α (ΔCt), dan metode ΔΔCt digunakan untuk menghitung tingkat ekspresi relatif dan induksi lipatan dibandingkan dengan sampel dari kelompok kontrol.
2.11 Histopatologi dan Hibridisasi In Situ
Seluruh alevin yang difiksasi formalin tertanam, dan orientasinya memungkinkan irisan sagital mencakup berbagai struktur anatomi. Irisan serial disiapkan untuk pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) dan hibridisasi in situ menggunakan RNAscope 2.5 HD Singleplex Red Chromogenic Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics Inc., Newark, CA, AS). Prosedur ini dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Thoen et al. ( 2020 )). Singkatnya, slide yang tidak diwarnai dideparafinisasi dalam xilena dan direhidrasi dalam etanol 100%, diikuti dengan perlakuan dengan hidrogen peroksida pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian, irisan direbus dalam buffer pengambilan target selama 15 menit dan diinkubasi dengan protease pada suhu 40°C selama 15 menit. Hibridisasi probe dilakukan menggunakan probe yang menargetkan gen SGPV B22R1 , yang merupakan penanda awal infeksi SGPV (Amundsen et al. 2021 ), atau gen SGPV D13L yang sangat terkonservasi (Gjessing et al. 2015 ) (Advanced Cell Diagnostics, Cat. No. 1000871-C1 dan 540201). Probe dihibridisasi selama 2 jam, diikuti oleh inkubasi penguat sinyal (AMP1–AMP6) menurut protokol pabrik (40°C selama 15 atau 30 menit). Akhirnya, kromogen merah cepat digunakan untuk memvisualisasikan sinyal hibridisasi, sebelum pewarnaan tandingan menggunakan hematoksilin Mayer (Chemi Teknikk, Oslo, Norwegia, Cat. No. 5B-535) yang diencerkan dalam air suling 1:1 selama 2 menit.
2.12 Statistik
Uji Wilcoxon/Kruskal–Wallis, diikuti oleh beberapa perbandingan, digunakan untuk menguji signifikansi perbedaan kadar mRNA gen stres antara kelompok alevin yang terpapar stresor berbeda pada setiap titik waktu berbeda yang dianalisis setelah induksi stres (Eksperimen 2: alevin yang terpapar bahan yang terinfeksi SGPV yang disimpan pada suhu -20°C). Perbedaan viral load yang signifikan secara statistik antara kelompok pada titik waktu berbeda dalam Eksperimen 3a (alevin yang terpapar bahan yang terinfeksi SGPV yang disimpan pada berbagai suhu beku) dihitung menggunakan uji Mann–Whitney nonparametrik dua sisi. Tingkat signifikansi ditetapkan pada p < 0,05. GraphPad Prism 10.1.0 digunakan untuk membuat grafik yang disajikan dalam karya ini.
3 Hasil
3.1 Ikan Salmon Atlantik Alevins Dapat Terinfeksi Secara Eksperimental oleh SGPV
Dalam Percobaan 1, alevin dipaparkan ke ikan terinfeksi SGPV yang tidak dibekukan atau insang yang dibedah dari CM1.
Pada hari ke-4 dan ke-12 pasca-paparan (DPE), beberapa sel epitel insang yang mengalami apoptosis diwarnai untuk SGPV melalui hibridisasi in situ RNA scope (Gambar 2 ). Beberapa pewarnaan untuk SGPV terlihat pada sel epitel di insang, rongga mulut, kulit, dan sirip dada.
SGPV-qPCR menunjukkan nilai Ct positif (wadah 1: median 29,3 dan wadah 2: median 30,7) pada 4 DPE. Pada 12 DPE, tidak ada perubahan signifikan dalam beban virus yang tercatat di salah satu dari dua wadah (wadah 1: median 29,4 dan wadah 2: median 29,2). Lebih jauh lagi, tidak ada perubahan signifikan dalam beban virus yang tercatat pada 25 DPE (wadah 1: median 28,0 dan wadah 2: median 27,2) (Tabel 1 ). Secara keseluruhan, lima alevin dari wadah 2 mati, dan tidak ada kematian yang diamati dalam wadah 1. Dua dari alevin yang mati dianalisis untuk SGPV menggunakan qPCR, menunjukkan nilai Ct sebesar 28,4 dan 25,1. Alevin yang mati yang tersisa diawetkan dalam formalin, tetapi tidak dapat dievaluasi karena autolisis
3.2 Tidak Ada Infeksi SGPV yang Dikonfirmasi pada Alevin yang Stres yang Terpapar Bahan Tantangan yang Disimpan pada Suhu − 20°C
Pada Percobaan 2, CM1 digunakan sebagai bahan tantangan karena telah dipastikan infektif pada Percobaan 1. CM1 kini telah disimpan pada suhu -20 ° C selama 3 bulan.
Alevin dari semua kelompok pada 8 DPE dipastikan negatif untuk SGPV menggunakan qPCR. Untuk memastikan bahwa alevin yang terpapar pada kondisi stres yang berbeda merespons seperti yang diharapkan, kadar mRNA gen yang terkait dengan stres dianalisis. Hasilnya tidak menunjukkan perubahan signifikan pada kadar mRNA CYP3A atau GR hingga 3 jam setelah induksi stres. Namun, pada 27 jam, alevin yang terpapar suhu tinggi menunjukkan ekspresi CYP3A yang secara signifikan lebih tinggi ( p = 0,01) dan GR ( p = 0,03) dibandingkan dengan kelompok kontrol tanpa stres (Gambar 3 ). Pada kelompok hipoksia, kadar transkrip secara signifikan lebih rendah untuk CYP3A ( p = 0,02) dan GR ( p = 0,03) pada 27 jam (Gambar 3 ). Alevin yang terpapar hidrokortison tidak mengalami perubahan pada kadar mRNA dari semua gen yang diuji. Lebih jauh lagi, ekspresi Hsp70, P450scc, dan StAR tidak berubah sebagai respons terhadap stresor apa pun (data tidak ditampilkan). Secara keseluruhan, dua alevin dari kelompok hipoksia dan satu alevin dari kelompok kortisol mati selama percobaan.
3.3 Alevins Dapat Terinfeksi Secara Eksperimental oleh SGPV Ketika Terpapar Bahan Tantangan yang Disimpan pada Suhu -80°C
Dalam Percobaan 3a, kami ingin menyelidiki hasil negatif untuk SGPV dalam Percobaan 2. Kami menyelidiki apakah suhu penyimpanan memengaruhi daya infeksi bahan tantangan. Pada 7 dan 13 DPE, beberapa sel epitel apoptotik diwarnai untuk SGPV dengan pemeriksaan RNA di insang dan rongga mulut. Pewarnaan juga diamati pada beberapa sel epitel kulit dan paling menonjol pada sirip dan sel epitel yang melapisi bagian dorsal kepala
SGPV-qPCR menunjukkan nilai Ct positif untuk semua alevin dalam wadah 3–5 yang diambil sampelnya pada 7 DPE (terpapar CM3; Gambar 5 ). Alevin yang terpapar bahan segar memiliki kadar SGPV yang secara signifikan lebih tinggi ( p = 0,0070) dengan median Ct sebesar 28,5 (kisaran 26,1–29,3), dibandingkan dengan alevin yang terpapar bahan tantangan yang disimpan pada suhu -80°C (median Ct sebesar 31,5 [kisaran 28,5–32,7]), dan dengan yang terpapar bahan tantangan yang dicairkan perlahan dari suhu -80°C ( p = 0,0006; median Ct sebesar 33,4 [kisaran 31,3–35,4]). Seiring berjalannya waktu, replikasi virus meningkat pada alevin dalam wadah 3–5, dan pada 13 DPE, semua alevin yang terpapar bahan segar mati. Tujuh individu yang mati dipilih secara acak untuk analisis SGPV-qPCR dan menunjukkan nilai Ct rendah dengan median 24,4 (kisaran 23,5–25,0). Nilai Ct untuk SGPV dalam alevin yang diambil sampelnya pada 13 DPE dalam wadah 4–5 memiliki median 25,8 (kisaran 23,4–27,1) dan 27,3 (kisaran 26,4–29,1) masing-masing (Gambar 5 ). Sampel yang terpapar CM1 dan CM2 dan sampel dari wadah kontrol (data tidak ditampilkan) diuji negatif untuk analisis SGPV-qPCR sepanjang Eksperimen 3a
3.4 Alevin yang terinfeksi SGPV dapat menularkan SGPV ke Alevin yang tidak terinfeksi
Dalam Percobaan 3b, penularan SGPV melalui kohabitasi dari alevin yang diduga terinfeksi ke alevin yang diduga tidak terinfeksi diuji. Pada 13 DPE, delapan alevin yang terinfeksi SGPV (sebelumnya terpapar CM3 yang dicairkan dengan lembut dalam Percobaan 3a) dipindahkan ke wadah 1 dan 2 dengan alevin SGPV-negatif (sebelumnya terpapar CM1 dan CM2 dalam Percobaan 3a dengan hasil qPCR SGPV negatif).
Setelah 11 hari pasca-kohabitasi (DPC), tujuh alevin dalam wadah CM1 dan delapan alevin dalam wadah CM2 ditemukan mati: qPCR untuk SGPV ikan yang mati menunjukkan nilai Ct median 26,0 dalam wadah CM1 dan CM2 (Tabel 2 ). Alevin yang tersisa dieutanasia keesokan harinya (12 DPC), dan jumlah virus yang lebih rendah dibandingkan dengan alevin yang mati terdeteksi, dengan nilai Ct median qPCR masing-masing 29,6 dan 30,4
Untuk mengonfirmasi bahwa infeksi SGPV berasal dari alevin shedder yang hidup bersama dan terinfeksi CM3, dan bukan dari paparan sebelumnya terhadap CM1 dan CM2, genotipe MLVA dilakukan pada cohabitant dan shredder di akhir percobaan dan bahan tantangan. Hasilnya menunjukkan profil MLVA yang identik di seluruh 32 alevin yang dianalisis dari Percobaan 3b, yang juga cocok dengan profil CM3 tetapi berbeda dalam 5–6 dari 8 lokus VNTR dari profil CM1 dan CM2 (Gambar 6 ). Delapan dari 40 alevin tidak dianalisis baik karena keterbatasan templat DNA atau kurangnya produk PCR.
3.5 Insang yang Dihomogenkan dan Diinfeksi SGPV Secara Utuh Sama-sama Infektif terhadap Alevins dan Dapat Digunakan Secara Eksperimental untuk Tantangan Virus
Dalam Percobaan 4, kami menggunakan bahan yang sama (CM3) seperti yang digunakan dalam tangki tempat SGPV berhasil dipindahkan dalam Percobaan 3. Dalam Percobaan 4, perbedaan daya infeksi antara seluruh insang yang terinfeksi SGPV dan suspensi homogen dari insang tersebut dibandingkan, dan dampak pembaruan air terus-menerus diselidiki. Pada saat ini, CM3 telah disimpan pada suhu -80°C selama 6 bulan. Pada 8 dan 15 DPE, apoptosis beberapa sel epitel terlihat di insang, rongga mulut dan kulit, dan apoptosis yang lebih luas di bagian yang lebih halus. Infeksi dengan SGPV telah diverifikasi pada pengambilan sampel pertama, tepat setelah pembuangan bahan tantangan, dikonfirmasi oleh pewarnaan positif yang jarang oleh B22R di insang (tidak ditampilkan); pada titik waktu tersebut, pewarnaan untuk D13L negatif.
Analisis SGPV-qPCR dari alevin yang terpapar pada seluruh insang yang terinfeksi dan suspensi homogennya positif pada kedua kelompok. Alevin yang terpapar pada seluruh insang yang terinfeksi menunjukkan nilai Ct median sebesar 34,0 dan 38,2 pada 8 dan 15 DPE masing-masing (Tabel 3 ). Menariknya, alevin yang terpapar pada homogenat insang memiliki nilai Ct yang lebih rendah (jumlah virus lebih tinggi) dibandingkan dengan yang terpapar pada seluruh insang yang terinfeksi, menunjukkan nilai Ct sebesar 33,9 pada 8 dan 15 DPE. Tidak ada kematian yang diamati selama percobaan. Sampel dari kedua kelompok kontrol diuji negatif untuk SGPV selama percobaan.
4 Diskusi
Penyakit virus cacar insang salmon merupakan masalah penting dalam industri budidaya salmon (Norwegian Veterinary Institute, 2023). Karena SGPV belum dibudidayakan, bahan infeksius dari wabah SGPVD digunakan untuk tantangan infeksi eksperimental, dan pemrosesan serta penyimpanan bahan tersebut yang tepat sangat penting untuk keberhasilan penelitian ini. Dalam penelitian ini, kami mempelajari pengaruh pemrosesan dan penyimpanan bahan tantangan terhadap keberhasilan pengaturan infeksi yang dikendalikan SGPV pada salmon alevin. Tantangan logistik menyebabkan kurangnya tangki replikasi, yang merupakan keterbatasan penelitian ini, tetapi lebih banyak sumber daya akan dipertimbangkan dalam penelitian mendatang untuk memperkuat keandalan dan generalisasi temuan. Selain itu, terkait tantangan mengakses SGPV dalam bentuk yang dibudidayakan atau dimurnikan, yang membuat penetapan kurva standar untuk kuantisasi virus menjadi tidak layak, kami sedang dalam proses mengembangkan konsep gBlock, yang saat ini sedang dalam tahap optimalisasi, tetapi belum beroperasi. Akibatnya, kami mengandalkan nilai Ct mentah dari SGPV D13L untuk membandingkan viral load antara kelompok dalam percobaan kami. Dalam konteks analisis SGPV D13L, kami percaya bahwa menormalkan atau mengukur secara relatif nilai Ct virus D13L menggunakan gen housekeeping salmon bisa saja menyesatkan karena apoptosis epitel yang diinduksi virus—kondisi seluler yang dapat dikaitkan dengan ekspresi tidak stabil dari beberapa gen housekeeping (Shu et al. 2019 ). Dalam penelitian ini, meskipun mengandalkan ekstraksi DNA otomatis dan prosedur qPCR, yang kami percaya meminimalkan variabilitas dalam nilai Ct, interpretasi nilai Ct mentah harus dibatasi pada pengaturan dan kondisi eksperimen spesifik yang digunakan.
Dalam penelitian ini, insang segar yang mengandung SGPV serta insang yang disimpan pada suhu -80°C tetap dapat menular ketika digunakan sebagai bahan tantangan untuk salmon alevin. Sebaliknya, bahan yang disimpan pada suhu -20°C tampaknya kehilangan daya infeksinya. Percobaan sebelumnya dengan SGPV pada ikan salmon muda menunjukkan bahwa ketika disuntik dengan hidrokortison untuk mensimulasikan stres, ikan muda tersebut menunjukkan tanda-tanda SGPVD yang jelas dan menunjukkan viral load yang tinggi. Sebagai perbandingan, ikan muda yang terpapar SGPV tanpa pengobatan hidrokortison tidak menunjukkan tanda-tanda klinis penyakit (Thoen et al. 2020 ). Namun, dalam penelitian ini, modulasi gen yang terkait dengan stres seperti CYP3A dan GR (yang sebelumnya dikaitkan dengan respons stres pada salmonid) (Geslin dan Auperin 2004 ) menunjukkan bahwa tidak adanya stres bukanlah faktor yang berkontribusi terhadap hasil qPCR SGPV negatif pada alevin yang terpapar bahan SGPV yang disimpan pada suhu -20°C. Temuan ini menggarisbawahi pentingnya kondisi penyimpanan yang tepat untuk bahan yang dimaksudkan untuk mempertahankan daya infeksi eksperimen infeksi SGPV.
Beberapa poxvirus sangat stabil di lingkungan, sering kali tetap infektif selama beberapa dekade dalam bentuk kering (Buller dan Fenner 2009 ; Gould 1999 ). Namun, sampel virus beku dapat kehilangan daya infeksi pada suhu yang lebih tinggi dan pembentukan kristal es serta ketidakseimbangan elektrolit dapat merusak protein lapisan virus dan asam nukleat dalam sampel yang disimpan pada suhu -20°C (Olson et al. 2004 ; Pan et al. 2023 ; Tedeschi dan De Paoli 2011 ). Sejalan dengan penelitian ini, investigasi pada virus lain, termasuk bakteriofag MS2 dan virus herpes, telah menunjukkan bahwa -80°C ideal untuk menjaga daya infeksi, dengan proses pendinginan dan pencairan yang cepat meminimalkan kerusakan virus dibandingkan dengan metode yang lebih lambat (Barnhart dan Ash 1975 ; Olson et al. 2004 ). Kami menunjukkan bahwa insang yang terinfeksi SGPV yang digunakan sebagai bahan tantangan menunjukkan daya infeksi yang sama pada alevin seperti pada ikan yang terinfeksi SGPV secara keseluruhan. Penggunaan insang sebagai sumber bahan tantangan jelas meningkatkan reproduktifitas percobaan tersebut. Selain itu, homogenat insang yang dikumpulkan dari ikan yang terinfeksi SGPV sama-sama infektif seperti insang yang terinfeksi secara keseluruhan dan oleh karena itu dapat direkomendasikan dalam tantangan eksperimental SGPV di masa mendatang. Meskipun perbandingan satu-satu antara berbagai percobaan mungkin tidak tepat, analisis SGPV D13L mengungkapkan tren umum beban virus yang rendah (seperti yang dinilai dari nilai Ct mentah) pada alevin yang terpapar virus dalam sistem dengan pembaruan air dibandingkan dengan yang ada di tangki tertutup. Pergantian air terus-menerus kemungkinan dapat mengurangi konsentrasi partikel infeksius SGPV di air tangki selama periode tantangan. Kecenderungan beban SGPV yang lebih tinggi (seperti yang dinilai dari nilai Ct mentah yang lebih rendah) pada alevin yang terpapar homogenat insang dibandingkan dengan kelompok yang terpapar insang utuh dapat disebabkan oleh lebih banyak partikel virus yang dilepaskan dari sel epitel insang yang diproses dari jaringan insang yang dihomogenkan ke kolom air. Apoptosis sel epitel pernapasan merupakan ciri khas SGPVD. Sel-sel yang melepaskan ini mengandung banyak partikel virus dewasa (Gjessing et al., 2015 ; Gjessing et al. 2017 ), dan kemungkinan besar pemrosesan insang yang terinfeksi melisiskan sel yang mengandung partikel SGPV dewasa. Lebih jauh lagi, bahan tantangan dalam bentuk cair larut lebih cepat daripada jaringan yang tidak dihomogenkan. Keberhasilan penggunaan homogenat insang merupakan temuan yang signifikan untuk uji coba infeksi di masa depan, karena hasil kami menunjukkan bahwa daya infeksinya lebih tinggi dibandingkan dengan jaringan yang tidak dihomogenkan. Selain itu, menangguhkan SGPV dalam bentuk cair memungkinkan reproduktifitas dalam eksperimen infeksi, karena bahan infeksius tetap konsisten di berbagai uji coba.
Pewarnaan untuk SGPV dalam sel epitel insang sesuai dengan penelitian sebelumnya pada salmon Atlantik (Thoen et al. 2020 ). Saat menganalisis irisan histologis alevin mirip ikan kecil, kami mendapat manfaat dari beberapa struktur anatomi yang disertakan dalam irisan yang sama. Pewarnaan untuk SGPV tidak hanya terlihat pada insang, tetapi juga pada sel epitel yang menutupi rongga mulut seperti yang dilaporkan dalam penelitian sebelumnya (Gjessing et al., 2018 ) dan yang menarik pada sel epitel kulit. Pada salmon dewasa, pertukaran gas terutama terjadi pada insang. Namun, pada alevin, kulit telah disarankan untuk memainkan peran penting sebagai organ pertukaran gas (Wells dan Pinder 1996b ; Zimmer et al. 2020 ). Pada salmon yang baru menetas, hingga 80% penyerapan O2 diperkirakan terjadi melalui lapisan tipis kulit dan kantung kuning telur (Wells dan Pinder 1996a , 1996b ). Jika epitel kulit alevin berfungsi sebagai organ pernapasan sementara hingga insang berkembang sepenuhnya, deteksi virus pada kulit alevin dan insang dewasa menunjukkan bahwa infeksi virus mungkin dimediasi oleh satu atau lebih molekul yang terlibat dalam proses pernapasan.
SGPV merusak penghalang epitel di insang baik secara fisik maupun imunologis (Gjessing et al., 2020 ) dan telah disarankan bahwa SGPV dapat menyebabkan penyakit insang yang kompleks (Gjessing et al. 2021 ). Dapat diperkirakan apakah infeksi SGPV di kulit dapat memfasilitasi infeksi kulit bakteri atau jamur sekunder, karena melemahnya penghalang epitel kulit secara fisik meningkatkan kerentanan. Lebih jauh, analisis transkriptom insang yang terinfeksi SGPV menunjukkan keadaan imunodefisiensi (Gjessing et al. 2020 ) dan proses serupa mungkin terjadi pada kulit yang terinfeksi SGPV dan dilaporkan untuk virus cacar lainnya (Chu et al. 2011 ).
Melakukan percobaan dengan alevin membutuhkan sedikit sumber daya, dan tidak diperlukan persetujuan dari Otoritas Keamanan Pangan Norwegia. Keberhasilan infeksi SGPV eksperimental pada alevin dapat memenuhi beberapa tujuan penelitian tentang SGPV. Alevin berukuran kecil yang terinfeksi SGPV, misalnya, dapat menawarkan sumber penyebaran virus yang berkelanjutan untuk penelitian in vitro yang bertujuan untuk membangun sistem kultur virus. Hasilnya menyoroti pentingnya memasukkan pengujian poxvirus di tempat penetasan salmon. Alevin dengan potensi infeksi poxvirus subklinis dapat disarankan sebagai kemungkinan asal wabah virus di fasilitas pemeliharaan salmon pada tahap akhir siklus hidup salmon. Singkatnya, penelitian ini menunjukkan bahwa alevin salmon Atlantik dapat terinfeksi oleh SGPV, dengan keberadaan virus dikonfirmasi di insang, rongga mulut, dan sel epitel kulit. Temuan kami menunjukkan bahwa mempertahankan virus pada suhu -80°C sangat penting untuk menjaga daya infeksinya, yang menggarisbawahi pentingnya kondisi penyimpanan dalam penelitian dan tindakan pengendalian SGPV di masa mendatang. Wawasan ini dapat meningkatkan pemahaman kita tentang penularan SGPV di tempat penetasan dan menginformasikan praktik pengelolaan penyakit.
