Abstrak
Mikroba membentuk kesehatan lebah, kelompok penyerbuk penting, termasuk spesies yang perlu dilestarikan. Sebagian besar penelitian mikroba pada lebah berfokus pada patogen eukariotik dan virus atau mikrobioma usus inti, komunitas simbion bakteri khusus inang yang membantu melindungi inang dari patogen eukariotik.
Lebah juga mengandung jenis mikroba ketiga: bakteri usus non-inti, yang tidak spesifik terhadap inangnya dan bervariasi di antara individu. Memahami peran fungsional mereka dan bagaimana mereka berinteraksi dengan simbion inti penting bagi ekologi dan pengelolaan lebah.
Kami mensurvei bakteri non-inti pada lebah pekerja liar ( Bombus impatiens ) dan melakukan eksperimen laboratorium dengan gnotobiotik B. impatiens untuk memeriksa faktor-faktor yang membentuk kolonisasi oleh bakteri non-inti fokus ( Serratia marcescens ) dan konsekuensinya bagi kesehatan lebah.
Bakteri non-inti, termasuk Serratia , sering muncul dalam jumlah besar pada lebah liar, dengan sekitar setengah dari individu tersebut mengandung sedikitnya 10% bakteri usus non-inti. Eksperimen menunjukkan bahwa Serratia marcescens lebih baik menjajah usus ketika lebah diinokulasi lebih awal (dalam waktu 1 hari setelah kemunculan dewasa) dan mikrobioma usus inti terganggu. Diet serbuk sari bunga liar campuran memfasilitasi tingkat infeksi tertinggi dibandingkan dengan dua perawatan serbuk sari monofloral. Kami juga memberikan bukti bahwa Serratia bersifat patogen: mengekspos lebah dengan mikrobioma usus yang terganggu ke Serratia sangat mengurangi umur dan, sebagai hasilnya, juga mengurangi reproduksi total.
Hasil ini memiliki tiga implikasi penting: pertama, bakteri non-inti tersebar luas pada lebah liar, dan beberapa spesies merupakan patogen oportunistik. Kedua, mikrobioma usus inti memainkan peran penting dalam melindungi terhadap patogen ini. Ketiga, waktu inokulasi relatif terhadap usia lebah, serta pola makan, merupakan faktor kunci yang mengendalikan kolonisasi bakteri patogen pada usus. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa kesehatan bakteri usus dapat menjadi target penting untuk memantau dan mengelola kesehatan lebah.
1. PENDAHULUAN
Lebah ( Bombus spp.) adalah penyerbuk utama tanaman liar dan hasil panen (Drummond, 2012 ; Strange, 2015 ), namun banyak populasi yang menurun dengan cepat (Cameron et al., 2011 ). Beberapa faktor telah terlibat, di antaranya penyakit memainkan peran utama (Cameron et al., 2016 ; Meeus et al., 2011 ). Lebah juga merupakan model penting untuk memahami ekologi evolusi mikrobioma dan penyakit (Koch & Schmid-Hempel, 2011b , 2012 ; Schmid-Hempel, 2001 ). Dengan demikian, memahami identitas dan ekologi mikroba yang terkait dengan lebah memiliki implikasi untuk konservasi dan penelitian mendasar tentang interaksi inang–mikroba.
Sebagian besar penelitian tentang mikroba yang berasosiasi dengan lebah madu berfokus pada dua kelompok – patogen eukariotik atau virus, dan simbion bakteri usus inti. Patogen seperti Crithidia, Vairimorpha, Apicystis, dan virus sayap cacat tersebar luas pada lebah madu dan dapat mengurangi kebugaran (Cordes et al., 2012 ; Figueroa, Sadd, et al., 2023 ; Fürst et al., 2014 ; Genersch et al., 2006 ; Pascall et al., 2021 ). Karena karya dasar Koch dan Schmid-Hempel ( 2011a , 2011b , 2012 ) menunjukkan bahwa lebah madu memiliki sekumpulan bakteri usus khusus yang membantu mempertahankan diri terhadap infeksi Crithidia , penelitian telah berkembang untuk mencakup mikrobioma usus inti dan interaksinya dengan patogen eukariotik. Simbion bakteri inti, yang mengkolonisasi usus lebah dewasa, meliputi Snodgrassella, Gilliamella, Schmidhempelia, dan garis keturunan spesifik lebah dari Lactobacillus dan Bifidobacteriaceae (Hammer, Le, Martin, et al., 2021 ). Simbion-simbion tersebut sangat terpelihara di seluruh populasi dan spesies dan berbeda dari simbion-simbion yang berasosiasi dengan serangga lain (Hammer, Le, Martin, et al., 2021 ; Koch & Schmid-Hempel, 2011a ; Kwong, Medina, et al., 2017 ; Villabona et al., 2023 ). Saat ini, fungsi ekologi utama yang diketahui dari simbion-simbion tersebut adalah mengurangi infeksi oleh patogen Crithidia bombi (Koch & Schmid-Hempel, 2011b , 2012 ; Mockler et al., 2018 ).
Kelompok ketiga, mikroba terkait lebah yang kurang dipelajari adalah bakteri usus non-inti, yang ditemukan di berbagai spesies Bombus dan benua (Cariveau et al., 2014 ; Li et al., 2015 ; Meeus et al., 2015 ; Villabona et al., 2023 ). Bakteri non-inti terjadi pada banyak mikrobioma terkait inang dan didefinisikan sebagai tidak spesifik inang dan sangat bervariasi dalam kelimpahan dan komposisi di antara individu (Neu et al., 2021 ; Perlman et al., 2022 ; Shade & Handelsman, 2012 ). Sementara bakteri inti biasanya mendominasi mikrobioma usus lebah, beberapa individu dikolonisasi hampir secara eksklusif oleh bakteri non-inti (Li et al., 2015 ; Villabona et al., 2023 ), kemungkinan diperoleh dari lingkungan. Namun, ekologi dan fungsi bakteri non-inti masih kurang dipahami. Beberapa taksa bisa menjadi patogen oportunistik, meskipun kemungkinan ini sebagian besar diabaikan karena fokus yang hampir eksklusif pada patogen dan virus eukariotik (Figueroa, Sadd, et al., 2023 ; Macfarlane et al., 1995 ). Atau, bakteri non-inti dapat memiliki efek minimal atau bahkan menguntungkan inangnya (Cariveau et al., 2014 ; Mockler et al., 2018 ; Praet et al., 2018 ). Pemahaman yang lebih baik tentang ekologi dan fungsi bakteri non-inti berpotensi untuk menginformasikan pengelolaan dan konservasi lebah. Misalnya, beberapa spesies dapat dikembangkan menjadi probiotik untuk lebah yang dikelola (Motta et al., 2022 ; Peixoto et al., 2022 ). Untuk lebah liar, bakteri non-inti mungkin menunjukkan kesehatan populasi. Secara keseluruhan, mengetahui faktor ekologi yang mengatur bakteri non-inti dapat menginformasikan pengelolaan lebah.
Sebagian besar pengetahuan tentang bakteri usus non-inti pada lebah berasal dari lebah madu Barat ( Apis mellifera ). Lebah madu berbagi banyak simbion bakteri inti dengan lebah (Kwong & Moran, 2016 ) dan menjadi inang bagi berbagai bakteri non-inti, termasuk beberapa patogen oportunistik (Fünfhaus et al., 2018 ; Lang et al., 2022 ). Misalnya, galur Serratia marcescens yang diisolasi dari usus lebah madu dapat menyebabkan sepsis dan kematian jika tertelan (Braglia et al., 2024 ; Raymann et al., 2018 ). Mikrobioma usus inti membantu melindungi terhadap patogen ini (Lang et al., 2022 ; Steele et al., 2021 ). Namun, masih belum jelas bagaimana informasi ini dapat diterapkan pada lebah, mengingat perbedaan penting antara kedua kelompok dalam biologi dan mikrobioma mereka (Hammer, Le, Martin, dkk., 2021 ).
Faktor-faktor yang memengaruhi kolonisasi bakteri non-inti pada lebah masih kurang dipahami. Dua faktor utama yang saling berhubungan adalah imunitas endogen dan mikrobioma usus inti. Imunitas epitel usus diketahui mengatur kolonisasi mikroba pada lebah dan serangga lainnya (Deshwal & Mallon, 2014 ; Engel & Moran, 2013 ). Mikrobioma usus inti juga dapat memberikan resistensi kolonisasi (yaitu menghambat infeksi; Caballero-Flores et al., 2023 ) terhadap bakteri non-inti, seperti yang terlihat pada Crithidia bombi (Koch & Schmid-Hempel, 2011b , 2012 ; Mockler et al., 2018 ). Pada lebah, ekspresi gen imun dan kelimpahan bakteri usus inti keduanya meningkat dalam 4 hari pertama masa dewasa (Hammer et al., 2023 ). Oleh karena itu, usia lebah saat inokulasi dapat memengaruhi kolonisasi bakteri non-inti melalui efek independen dan interaktif dari kekebalan inang dan mikrobioma usus inti.
Diet adalah faktor lain yang dapat memengaruhi kolonisasi usus oleh bakteri non-inti. Sebagai generalis, lebah mencari makan dari tanaman yang berbeda di ruang dan waktu (Goulson, 2003 ). Spesies tanaman bervariasi dalam komposisi nutrisi dan kimia nektar dan serbuk sarinya (Palmer-Young et al., 2019 ; Vaudo et al., 2015 , 2016 ). Variasi sumber daya bunga dan preferensi mencari makan dapat memengaruhi kolonisasi bakteri non-inti. Misalnya, serbuk sari bunga matahari telah terbukti mengurangi infeksi oleh Crithidia bombi di Bombus impatiens (Figueroa, Sadd, et al., 2023 ; Fowler et al., 2019 , 2022 ; Giacomini et al., 2018 ). Komposisi serbuk sari juga dapat memiliki efek yang lebih halus pada keanekaragaman bakteri usus lebah (Fowler et al., 2024 ). Penelitian pada lebah madu mendukung interaksi serupa antara komposisi serbuk sari dan mikrobioma usus, yang berpotensi dimediasi oleh kekebalan (Castelli et al., 2020 ; Motta et al., 2023 ; Palmer-Young et al., 2017 ).
Dalam studi ini, kami meneliti distribusi bakteri non-inti pada lebah liar, faktor-faktor yang membentuk kolonisasi usus oleh bakteri non-inti fokal dan konsekuensinya bagi kesehatan lebah. Kami melakukan survei lapangan dan eksperimen laboratorium untuk menanyakan: (1) Seberapa lazimkah bakteri non-inti pada pekerja lebah liar ( Bombus impatiens )? (2) Apakah mikrobioma inti, usia saat inokulasi dan diet memengaruhi kolonisasi pekerja gnotobiotik B. impatiens oleh bakteri non-inti umum ( Serratia )? dan (3) Apa efek Serratia pada kelangsungan hidup dan reproduksi B. impatiens ? Temuan kami menyoroti bakteri non-inti sebagai faktor yang kurang dikenal yang memengaruhi populasi lebah dan menyarankan kemungkinan aplikasi untuk konservasi dan pengelolaan.
2 BAHAN DAN METODE
2.1 Mempelajari organisme
Lebah Bumblebee Timur Biasa ( Bombus impatiens ) adalah salah satu lebah bumblebee yang paling tersebar luas di Amerika Utara bagian timur (Novotny et al., 2021 ) dan penyerbuk utama banyak tanaman liar dan budidaya (Strange, 2015 ). Bombus impatiens sering dipelihara di penangkaran dan saat ini merupakan satu-satunya spesies lebah bumblebee yang tersedia secara komersial di Amerika Utara, menjadikannya sistem studi yang berguna untuk mengintegrasikan eksperimen laboratorium dengan observasi lapangan. Serratia adalah bakteri lingkungan umum yang ditemukan di usus lebah bumblebee, sering dikaitkan dengan mikrobioma inti usus yang terkuras atau paparan toksin (Li et al., 2015 ; Rothman et al., 2020 ). Serratia adalah patogen oportunistik dari banyak serangga, termasuk lebah madu (Burritt et al., 2016 ; Fünfhaus et al., 2018 ; Raymann et al., 2018 ). Di sini, kami menggunakan Serratia sebagai bakteri usus non-inti yang menjadi fokus. Eksperimen menggunakan strain berlabel S. marcescens KZ11, yang awalnya diisolasi dari usus lebah madu ( Apis mellifera ) (Raymann et al., 2018 ) dan dimodifikasi secara genetik untuk membawa penanda resistensi kanamisin (Steele et al., 2021 ).
2.2 Prevalensi bakteri non-inti pada lebah liar
Untuk menilai prevalensi bakteri non-inti pada lebah pekerja B. impatiens liar , kami mengambil sampel lebah dari 20 lokasi lapangan di dekat Madison, WI, Glencoe, IL, dan Amherst, MA, pada bulan Juni–Agustus 2023. Tidak diperlukan izin untuk mengumpulkan dari lokasi-lokasi ini. Kami menangkap 91 lebah pengumpul B. impatiens dengan jaring dan membedah usus mereka secara aseptik (usus belakang dan usus tengah). Setiap usus dihomogenkan dengan alu steril dan disimpan dalam gliserol 20% dalam larutan penyangga fosfat (PBS). Sampel dikirim semalaman di atas es ke University of California, Irvine, tempat sampel disimpan pada suhu −70°C. Kami mengekstraksi DNA dan melakukan pengurutan amplikon gen 16S rRNA (dirinci di bawah) untuk mengukur prevalensi bakteri non-inti, yang didefinisikan sebagai semua taksa di luar genera inti Snodgrassella, Gilliamella, Candidatus Schmidhempelia, Bifidobacterium, Bombiscardovia, dan Lactobacillus (Hammer, Le, Martin, et al., 2021 ; Kwong & Moran, 2015 ).
2.3 Mikrobioma inti, waktu inokulasi dan pengaruh diet terhadap kolonisasi Serratia
Bahasa Indonesia: Untuk memeriksa apakah mikrobioma usus inti dan waktu inokulasi memengaruhi kolonisasi bakteri non-inti B. impatiens , kami melakukan eksperimen laboratorium dengan lebah gnotobiotik dan strain Serratia marcescens yang diberi label (pengaturan eksperimen ditunjukkan pada Gambar 1a ). Eksperimen laboratorium ini tidak memerlukan persetujuan etis. Kami membuat mikrokoloni gnotobiotik yang dikontrol usia dari pekerja B. impatiens yang bersumber dari tiga koloni komersial (Beneficial Insectary, Biobest Group, CA, AS). Karena larva melepaskan lapisan usus mereka selama metamorfosis, orang dewasa yang baru muncul memiliki sedikit bakteri usus sebelum berinteraksi dengan teman sarang dan substrat sarang (Hammer & Moran, 2019 ; Zhang & Zheng, 2022 ). Jadi, untuk menciptakan lebah gnotobiotik, kami membuang gumpalan kepompong pupa dari setiap koloni dan mensterilkan permukaannya dalam pemutih 0,18% selama 90 detik (Hammer, Le, & Moran, 2021 ; Näpflin & Schmid-Hempel, 2018 ). Pupa disimpan dalam kondisi steril pada suhu 35°C dan dipantau setiap hari. Orang dewasa yang baru muncul (berusia <1 hari dan hampir bebas dari simbion usus) dipindahkan dalam kelompok yang terdiri dari tiga ke dalam mikrokoloni (Klinger et al., 2019 ) yang terdiri dari wadah plastik steril berukuran 16 ons dengan alas tidur. Setiap mikrokoloni dipelihara pada suhu 27°C dan diberikan sirup sukrosa 50% yang disterilkan dengan filter dan adonan serbuk sari steril (serbuk sari yang dikumpulkan oleh lebah madu yang digiling dan disterilkan dengan etilen oksida dari bunga liar dengan komposisi yang tidak diketahui (Koppert Biological Systems, MI, AS) dicampur dengan sirup sukrosa 50% steril) sepuasnya.
Bahasa Indonesia : Untuk menguji apakah mikrobioma usus inti memengaruhi kolonisasi Serratia , kami menerapkan perawatan transplantasi mikrobioma inti (‘M+’) dan penipisan (‘M−’) ke mikrokoloni saat mereka terbentuk (Gambar 1a ). Kami menginokulasi lebah M+ dengan homogenat usus dari lebah non-steril dari koloni asli yang sama (Koch & Schmid-Hempel, 2012 ; Mockler et al., 2018 ). Lebah yang dibesarkan di dalam ruangan umumnya hanya menjadi inang simbion inti (Hammer et al., 2023 ; Meeus et al., 2015 ), dan sekuensing gen 16S rRNA mengonfirmasi bahwa lebah M+ didominasi oleh simbion inti (lihat Bagian 3 ; Gambar S1.4 ). Untuk menyiapkan homogenat usus, enam pekerja dari koloni sumber dibius di atas es sebelum mengeluarkan, mengumpulkan, dan menghomogenkan usus mereka dalam 500 μL PBS. Mikrokoloni M+ diinokulasi dengan memipet 20 μL homogenat ini ke adonan serbuk sari steril, yang dapat dikonsumsi lebah secara bebas (Mockler et al., 2018 ; Powell et al., 2023 ). Mikrokoloni M− menerima 20 μL PBS steril sebagai kontrol. Lebah M− tidak sepenuhnya bebas mikroba; beberapa bakteri usus inti dan non-inti dapat dideteksi dari pengurutan, mungkin karena sterilisasi rumpun pupa, makanan atau kandang yang tidak lengkap (Gambar S1.4 ). Namun, kelimpahan bakteri total (diperkirakan menggunakan jumlah total pembacaan pengurutan gen 16S rRNA) jauh lebih rendah untuk lebah M− dibandingkan dengan lebah M+ (Gambar S1.3 ).
Kami memaparkan mikrokoloni ke Serratia saat lebah berusia <1 hari (perlakuan ‘dini’; 12 mikrokoloni M+ dan 10 mikrokoloni M−) atau berusia 4–5 hari (perlakuan ‘akhir’; 10 mikrokoloni M+ dan 9 mikrokoloni M−; Gambar 1a ), karena periode ini menunjukkan pergeseran kuat dalam mikrobioma usus inti dan ekspresi gen imun (Hammer et al., 2023 ). Untuk perlakuan Serratia (‘S+’), kami memipet sekitar 108 unit pembentuk koloni (CFU) kultur S. marcescens semalam dalam 20 μL PBS ke adonan serbuk sari. Sebagai kontrol (‘S−’), empat mikrokoloni M+ awal, lima mikrokoloni M− awal, lima mikrokoloni M+ akhir, dan lima mikrokoloni M− akhir menerima larutan PBS steril 20 μL. Beberapa lebah S− akhirnya dikolonisasi oleh strain Serratia yang diberi label , yang menunjukkan adanya kontaminasi silang sesekali antara kandang. Lebih jauh, urutan gen 16S rRNA milik Serratia terlihat jelas pada beberapa lebah S−; urutan ini kemungkinan berasal dari strain berlabel kami tetapi juga dapat menunjukkan kontaminasi oleh strain Serratia lain di lingkungan pemeliharaan. Namun, di semua percobaan, Serratia muncul pada frekuensi dan kelimpahan yang jauh lebih tinggi pada lebah S+ (lihat Bagian 3 ). Lima hari setelah pengobatan Serratia , kami menilai kolonisasi dengan membius setiap lebah di atas es dan membuang isi perutnya (Gambar 1a ). Setiap isi perut dihomogenkan dengan alu steril dalam 1 mL PBS, diencerkan secara serial dan ditanam pada agar LB dengan 20 μg/mL kanamisin, dengan empat kali ulangan teknis per sampel. Setelah inkubasi 24 jam pada suhu 30°C, kami menghitung CFU untuk memperkirakan kelimpahan S. marcescens per isi perut (rentang deteksi 2,5 × 10 2 hingga 6 × 10 7 CFU). Homogenat isi perut yang tersisa disimpan pada suhu -20°C untuk ekstraksi DNA selanjutnya dan sekuensing amplikon gen 16S rRNA (dirinci di bawah) untuk menilai kolonisasi lebih lanjut oleh bakteri inti dan Serratia . Dalam percobaan terpisah, kami menguji bagaimana pola makan memengaruhi kolonisasi Serratia (Gambar 1b ). Kami membentuk mikrokoloni pekerja B. impatiens yang kekurangan mikrobioma gnotobiotik (M−) yang bersumber dari dua koloni komersial, seperti dijelaskan di atas. Setiap mikrokoloni menerima sirup sukrosa 50% yang disterilkan dengan filter sepuasnya dan adonan serbuk sari steril dalam satu dari tiga perlakuan: buckwheat monofloral ( Fagopyrum esculentum ; sembilan mikrokoloni), sunflower monofloral ( Helianthus annuus ; sembilan mikrokoloni) atau pollen bunga liar polifloral yang dijelaskan di atas (tujuh mikrokoloni; Gambar 1b ; LoCascio et al., 2019 ). Serbuk sari soba dan bunga matahari masing-masing bersumber dari Henan Zhuoyu Bee Products/Bee Farm Biotechnology Co., Ltd., Henan, Tiongkok, dan dari Bee Farm Biotechnology Co., Ltd., Henan, Tiongkok, dan disterilkan dengan iradiasi gamma (8 kGy). Sterilitas semua jenis serbuk sari dikonfirmasi dengan penyemaian pada LB dan agar darah Columbia. Pada hari ketika mikrokoloni terbentuk, semuanya diperlakukan dengan Serratia (yaitu semua dalam perlakuan inokulasi ‘awal’; Gambar 1b ). Lima hari kemudian, kami menilai kolonisasi Serratia seperti dijelaskan di atas dan memperkirakan konsumsi serbuk sari terkini sebagai jumlah butir serbuk sari per usus (Gambar 1b ). Untuk melakukannya, kami memipet 10 μL homogenat usus ke dalam hemositometer yang ditingkatkan Neubauer dan menghitung semua butir serbuk sari dalam dua replikasi teknis terpisah di bawah pembesaran 100X, mirip dengan Fowler et al. ( 2020 ). Jumlah butir serbuk sari mencerminkan konsumsi serbuk sari terkini dan buang air besar.
2.4 Dampak Serratia terhadap kelangsungan hidup dan reproduksi lebah Untuk menguji efek Serratia pada kesehatan B.impatiens , kami mengukur kelangsungan hidup dan reproduksi pekerja dewasa dalam desain faktorial 2 × 2 yang memanipulasi mikrobioma inti (M+/M−) dan Serratia (S+/S−), seperti yang dijelaskan di atas (Gambar 1c ). Lebah diambil dari satu koloni komersial, dan perlakuan diberikan pada hari mikrokoloni terbentuk (perlakuan inokulasi ‘dini’; Gambar 1c ). Mikrokoloni menerima larutan sukrosa 50% steril dan adonan serbuk sari ad libitum dan dipantau setiap 48–72 jam untuk kelangsungan hidup dan produksi jantan dewasa, karena pekerja lebah dominan yang dipisahkan dari koloni sering bertelur haploid (jantan) (Klinger et al., 2019 ). Semua pekerja yang mati dan jantan dewasa baru segera dikeluarkan dari mikrokoloni. Hasil reproduksi diukur pada akhir percobaan (46–50 hari, tergantung pada mikrokoloni; Gambar 1c ) dengan menghitung jumlah total telur, larva, pupa, dan jantan dewasa yang dihasilkan oleh setiap mikrokoloni.
2.5 Persiapan perpustakaan, pengurutan dan pemrosesan data amplikon 16S rRNA Kami mengekstraksi DNA genomik (gDNA) dari homogenat usus dari 91 pekerja yang dikumpulkan di lapangan dan 173 pekerja dari percobaan kolonisasi Serratia .
Pertama, 250 μL dari setiap homogenat usus ditempatkan dalam tabung yang berisi ~0,5 mL manik-manik silika zirkonia 0,1 mm dan 750 μL Larutan Lisis ZymoBIOMICS. Sampel diproses dalam pengocok manik pada 1800 rpm selama 2 menit, dibiarkan diam pada suhu kamar selama 1 menit, dan kemudian dikocok lagi selama 2 menit (Powell et al., 2014 ). Sampel yang telah lisis disimpan pada suhu −70°C hingga ekstraksi DNA, yang dilakukan dengan menggunakan Kit DNA ZymoBIOMICS 96. Dua blanko ekstraksi dan dua replikasi teknis standar komunitas mikroba ZymoBIOMICS juga disertakan. gDNA yang diekstraksi diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer universal berkode batang yang menargetkan wilayah V4 (515F/806R) dari gen 16S rRNA (Caporaso et al., 2023 ). Amplifikasi dilakukan dengan 23 μL 1X Platinum Hot Start PCR Master Mix, 1 μL primer berkode batang, dan 1 μL gDNA. Profil termal terdiri dari denaturasi awal pada 94°C selama 3 menit, diikuti oleh 35 siklus denaturasi pada 94°C selama 45 detik, annealing pada 50°C selama 60 detik dan elongasi pada 72°C selama 90 detik, dan diakhiri dengan elongasi akhir pada 72°C selama 10 menit. Produk PCR dibersihkan dan dinormalisasi menggunakan pelat normalisasi SequalPrep. Pustaka (termasuk dua kontrol PCR tanpa templat) dikumpulkan dan diurutkan pada Illumina MiSeq (2 × pembacaan 400 bp) di UC Irvine Genomics Research and Technology Hub. Pembacaan mentah tersedia di European Nucleotide Archive (PRJEB79856). Urutan diproses menggunakan QIIME 2 v2023.9 (Bolyen et al., 2019 ). DADA2 digunakan untuk denoising, truncating reads ke 240 basa, filtering urutan chimeric dan konstruksi tabel amplicon sequence variant (ASV) (Callahan et al., 2016 ). Pengurutan menghasilkan total 7,3 juta pembacaan, 787 ASV dan rata-rata 24.906 pembacaan per sampel. Taksonomi ditugaskan ke ASV menggunakan q2-feature-classifier (Bokulich et al., 2018 ) classify-sklearn menggunakan naïve Bayes classifier yang dilatih dengan database referensi SILVA v138 (Bokulich et al., 2018 ; Yilmaz et al., 2014 ). Beberapa ASV tidak terklasifikasi atau diidentifikasi hanya pada level Domain. Dalam kasus ini, kami secara manual mengklasifikasikan ASV yang paling banyak (100 teratas, >99% dari semua bacaan) menggunakan BLAST (Altschul et al., 1990 ). Untuk ASV dengan kecocokan 100% dengan beberapa taksa, kami menetapkan identifikasi dugaan sebagai genus dengan jumlah kecocokan terbanyak.
Bahasa Indonesia: Untuk mengidentifikasi kontaminan potensial, kami menggunakan fungsi ‘isContaminant()’ dalam paket ‘decontam’ (Davis et al., 2018 ) di R v4.1.1 (Tim Inti R, 2024 ). Metode ‘prevalensi’ mengidentifikasi kontaminan berdasarkan prevalensinya dalam blanko dan kontrol PCR tanpa templat dibandingkan dengan sampel sebenarnya. Kami mengidentifikasi 44 kontaminan, yang dihapus dari tabel ASV, bersama dengan ASV apa pun dengan total pembacaan kurang dari 100. Kami mengonfirmasi bahwa kedelapan taksa bakteri yang diharapkan hadir dalam kedua replikasi teknis standar komunitas mikroba dan mencakup >95% pembacaan. Tabel ASV final, taksonomi, dan metadata tersedia dari Dryad Data Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.qbzkh18t1 (Nelson et al., 2025 ).
2.6 Analisis statistik
Untuk memeriksa prevalensi bakteri non-inti pada mikrobioma lebah liar, kami menyusun model linear (‘LM’) dengan proporsi pembacaan non-inti per sampel (ditransformasikan dengan akar kuadrat) sebagai variabel respons dan lokasi/periode pengambilan sampel sebagai efek tetap. Kami memvisualisasikan komposisi mikrobioma di seluruh lokasi/periode pengambilan sampel menggunakan penskalaan multidimensi non-metrik (‘NMDS’) dengan indeks ketidakmiripan Bray–Curtis. Kami menguji perbedaan signifikan secara statistik dalam komposisi menggunakan analisis varians permutasi (‘PERMANOVA’) dengan 999 permutasi.
Untuk menentukan apakah mikrobioma inti dan waktu inokulasi memengaruhi kolonisasi Serratia , kami menyusun dua model efek campuran linier (‘LMER’). Model pertama menggunakan jumlah CFU S. marcescens per usus ( transformasi ln + 1) sebagai respons, sedangkan model kedua menggunakan proporsi urutan gen 16S rRNA yang merupakan Serratia per usus sebagai respons. Kedua model tersebut mencakup efek tetap dari pengobatan Serratia , pengobatan mikrobioma inti, pengobatan waktu inokulasi, dan ID koloni, beserta interaksi antara mikrobioma inti dan waktu inokulasi. ID mikrokoloni merupakan efek acak.
Untuk menguji apakah diet memengaruhi kolonisasi Serratia , kami menyusun LMER dengan CFU S. marcescens per usus ( ln + 1 yang ditransformasikan) sebagai variabel respons, perlakuan diet serbuk sari dan ID koloni sebagai efek tetap, dan ID mikrokoloni sebagai efek acak. Kami juga menyelidiki apakah perbedaan kolonisasi dapat didorong oleh tingkat konsumsi serbuk sari menggunakan LMER terpisah. Jumlah butir serbuk sari per usus ( ln yang ditransformasikan) adalah respons, dan perlakuan serbuk sari dan ID koloni adalah efek tetap, sedangkan ID mikrokoloni adalah efek acak.
Kami meneliti bagaimana Serratia memengaruhi kelangsungan hidup dan reproduksi B. impatiens dengan beberapa model. Untuk kelangsungan hidup, kami membangun model bahaya proporsional Cox dengan kemungkinan penalti Firth. Kelangsungan hidup lebah adalah responsnya, dengan perlakuan mikrobioma inti, perlakuan Serratia , dan interaksinya sebagai efek tetap. Untuk reproduksi, kami membangun LMER dengan reproduksi total di setiap mikrokoloni sebagai responsnya. Perlakuan mikrobioma inti, perlakuan Serratia , dan interaksinya adalah efek tetap, dan tanggal pembentukan mikrokoloni adalah efek acak. Untuk menguji apakah total hasil reproduksi mikrokoloni dapat didorong oleh perbedaan kelangsungan hidup lebah, kami membangun LMER tambahan yang juga mencakup sebagai kovariat jumlah hari semua lebah hidup dalam mikrokoloni.
Analisis statistik dilakukan di R v4.1.1 (Tim Inti R, 2024 ). LM dan LMER dibangun menggunakan fungsi ‘lm()’ dalam paket ‘stats’ (Tim Inti R, 2024 ) dan fungsi ‘lmer()’ dalam paket ‘lme4’ (Bates et al., 2015 ). Untuk menilai signifikansi efek tetap, kami melakukan uji F (untuk LM) atau uji chi-kuadrat Wald dengan jumlah kuadrat Tipe III (untuk LMER) menggunakan fungsi ‘Anova()’ dalam paket ‘car’ (Fox & Weisberg, 2019 ). Penahbisan NMDS dan PERMANOVA dilakukan menggunakan fungsi ‘metaMDS()’ dan ‘adonis2()’ (masing-masing) dalam paket ‘vegan’ (Oksanen et al., 2020 ). Untuk model bahaya proporsional Cox, kami menggunakan fungsi ‘coxphf()’ dalam paket ‘coxphf’ (Heinze et al., 2020 ) dan memperoleh nilai chi-kuadrat untuk menguji signifikansi efek menggunakan fungsi ‘summary()’ (R Core Team, 2024 ). Istilah interaksi yang tidak signifikan dihilangkan dari model sebelum menguji signifikansi efek tetap. Untuk efek utama yang signifikan dengan lebih dari dua level, kami melakukan uji Tukey menggunakan fungsi ‘glht()’ dalam paket ‘multcomp’ (Hothorn et al., 2008 ). Ukuran efek dihitung dari estimasi rata-rata marginal menggunakan fungsi ’emmeans()’ dalam paket ’emmeans’ (Lenth, 2021 ).
3 HASIL
3.1 Prevalensi bakteri non-inti pada lebah liar
Di antara pekerja B. impatiens liar , 43 individu (47,3%) mengandung setidaknya 10% bakteri non-inti dalam mikrobioma usus mereka (Gambar 2a ). Serratia , bakteri non-inti yang menjadi fokus percobaan laboratorium, terdapat pada 67% lebah liar, meskipun biasanya dalam jumlah relatif rendah (Gambar 2b ). Proporsi bakteri non-inti per usus berbeda di seluruh lokasi/periode pengambilan sampel ( F 1,3 = 10,07, p < 0,001; Gambar 2a ). Bahasa Indonesia: Pada awal musim panas di Madison, WI, mikrobioma usus pekerja terdiri dari 0,6 ± 0,9% (rata-rata ± 1SE) bakteri non-inti, yang secara signifikan lebih rendah daripada proporsi pada akhir musim panas di Madison (12,4 ± 3,1%; t = 3,81, p = 0,001) atau pertengahan musim panas di Glencoe, IL (10,4 ± 2,6%; t = 3,50, p = 0,004) atau Amherst, MA (21,9 ± 4,0%; t = 5,47, p < 0,001; Gambar 2a ). Kelimpahan relatif bakteri non-inti tidak berbeda di antara lebah Madison akhir musim panas atau lebah Glencoe atau Amherst pertengahan musim panas ( t ≤ 2,48, p ≥ 0,069 dalam semua pengujian). Selain itu, komposisi mikrobioma usus berbeda secara signifikan di seluruh lokasi pengambilan sampel/periode pengambilan sampel ( F 3,87 = 10,1, p < 0,001; Gambar S1.1 ). Kelimpahan relatif dari delapan dari 10 genus non-inti yang paling melimpah ( Pectobacterium , Apibacter , Arsenophonus, Fructobacillus, Pantoea, Zymobacter, Leuconostoc, dan Klebsiella/Raoultella ) berbeda secara signifikan di seluruh lokasi/periode pengambilan sampel
3.2 Mikrobioma inti, waktu inokulasi dan pengaruh diet terhadap kolonisasi SerratiaDalam pengujian percobaan untuk mikrobioma inti dan efek waktu inokulasi pada kolonisasi, perlakuan Serratia meningkatkan jumlah CFU Serratia per usus hingga >4000 kali lipat ( χ 2 = 82,94, p < 0,001; Gambar 3a ), yang menunjukkan efektivitas inokulasi. Serratia 93% kurang berlimpah dalam perlakuan transplantasi mikrobioma inti ( χ 2 = 6,41, p = 0,011) tetapi 13 kali lipat lebih berlimpah pada lebah yang diobati lebih awal (dibandingkan yang terlambat;
2 = 6,33, p = 0,012; Gambar 3a ). Koloni sumber juga memengaruhi kolonisasi ( χ 2 = 47,40, p < 0,001). Namun, interaksi antara perlakuan mikrobioma dan waktu inokulasi tidak signifikan ( χ 2 = 0,19, p = 0,666; Gambar 3a ).
Urutan gen 16S rRNA menghasilkan hasil yang serupa tetapi tidak identik, karena data ini adalah kelimpahan proporsional (bukan absolut) (Gambar 3b ; Gambar S1.3 ). Proporsi urutan Serratia per usus 30 kali lipat lebih besar dalam pengobatan Serratia ( χ 2 = 23,80, p < 0,001; Gambar 3b ). Transplantasi mikrobioma inti mengurangi kelimpahan relatif Serratia sebesar 113% ( χ 2 = 69,03, p < 0,001), meskipun waktu inokulasi tidak memiliki efek yang terdeteksi ( χ 2 = 1,38, p = 0,240; Gambar 3b ). Tidak ada pula efek yang terdeteksi dari koloni sumber ( χ 2 = 2,88, p = 0,237) atau interaksi antara mikrobioma inti dan waktu inokulasi ( χ 2 = 2,28, p = 0,131; Gambar 3b ). Dalam percobaan pengujian untuk efek diet pada kolonisasi, terdapat efek signifikan dari perlakuan diet serbuk sari ( χ2 = 10,68, p = 0,005) dan koloni sumber ( χ2 = 4,11, p = 0,043) pada jumlah CFU Serratia per usus (Gambar 4a ). Kolonisasi Serratia >2000 kali lipat lebih tinggi pada lebah yang diberi makan serbuk sari bunga liar dibandingkan dengan serbuk sari soba ( Z = 3,20, p = 0,004). Itu juga rata-rata 66 kali lipat lebih tinggi pada lebah yang diberi makan bunga matahari dibandingkan soba ( Z = 2,02, p = 0,107) dan 30 kali lipat lebih tinggi pada lebah yang diberi makan serbuk sari bunga liar dibandingkan dengan bunga matahari ( Z = 2,37, p = 0,317), meskipun perbedaan ini tidak signifikan secara statistik. Tidak terdeteksi adanya pengaruh perlakuan serbuk sari ( χ 2 = 0,28, p = 0,868) atau koloni sumber ( χ 2 = 0,03, p = 0,873) terhadap jumlah butir serbuk sari per usus (Gambar 4b ).
3.3 Dampak Serratia terhadap kelangsungan hidup dan reproduksi lebah
Serratia mengurangi kelangsungan hidup B. impatiens dan, sebagai akibatnya, reproduksi. Serratia secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup lebah ( χ2 = 10,84, p < 0,001), dan ada tren yang tidak signifikan bagi efek tersebut untuk menjadi lebih kuat tanpa adanya mikrobioma usus inti ( χ2 = 3,53, p = 0,060; Gambar 5a ), meskipun tidak ada efek utama yang terdeteksi dari perlakuan mikrobioma inti ( χ2 = 0,41, p = 0,503; Gambar 5a ). Lebih jauh lagi, Serratia mengurangi total hasil reproduksi mikrokoloni sebesar 28% ( χ2 = 4,29, p = 0,038). Reproduksi tidak bergantung pada perawatan mikrobioma inti ( χ2 = 1,08, p = 0,299 ) atau interaksi antara Serratia dan perawatan mikrobioma inti ( χ2 = 1,23, p = 0,268; Gambar 5b ). Setelah memperhitungkan efek signifikan dari jumlah hari setiap lebah hidup (dijumlahkan di semua lebah dalam mikrokoloni) ( χ2 = 9,88, p = 0,002), efek Serratia pada reproduksi tidak lagi signifikan ( χ2 = 0,53, p = 0,467). Ini menunjukkan bahwa Serratia tidak mengurangi tingkat reproduksi lebah individu secara langsung tetapi malah mengurangi total hasil reproduksi mikrokoloni melalui pengurangan umur pekerja.
4 DISKUSI
Dengan menggunakan survei lapangan dan eksperimen laboratorium, kami menyelidiki faktor-faktor yang membentuk bagaimana bakteri non-inti, kelas simbion usus yang kurang dipahami, menjajah dan memengaruhi kesehatan lebah. Penelitian ekologi mikroba sering kali berfokus pada mikrobioma inti—rangkaian taksa yang secara konsisten hadir di antara individu atau populasi—karena kepentingan fungsionalnya yang dianggap (Neu et al., 2021 ). Lebah sosial, termasuk lebah, memiliki mikrobioma usus inti yang dapat didefinisikan dengan jelas yang terdiri dari beberapa garis keturunan bakteri khusus inang (Hammer, Le, Martin, et al., 2021 ; Kwong, Medina, et al., 2017 ; Kwong & Moran, 2016 ). Studi ini berfokus pada bakteri non-inti, bakteri yang tidak selalu ada di antara lebah dan tidak terspesialisasi pada lebah, melainkan menjadi ciri khas bunga, serangga lain, atau substrat lingkungan yang beragam (misalnya Czajkowski et al., 2011 ; Nováková et al., 2009 ; Russell & McFrederick, 2022 ). Kami mencatat bahwa konsep mikroba inti versus non-inti mungkin tidak mudah diterapkan pada inang lain, termasuk lebah soliter (Voulgari-Kokota et al., 2019 ), yang secara inheren memiliki mikrobioma yang bervariasi dan diperoleh dari lingkungan.
Kami menemukan bahwa bakteri non-inti sering muncul dalam jumlah yang tinggi pada masing-masing lebah liar, yang sesuai dengan penelitian sebelumnya pada B. impatiens (Cariveau et al., 2014 ). Kami juga menemukan bahwa kelimpahan relatif taksa non-inti yang umum sangat bervariasi di seluruh lokasi dan periode pengambilan sampel. Variabilitas ini dapat didorong oleh beberapa faktor, seperti perbedaan usia lebah atau koloni individu (Hammer et al., 2023 ; Parmentier et al., 2016 ) atau kelimpahan bakteri pada bunga (von Arx et al., 2019 ). Dalam kasus yang ekstrem, sekelompok individu (baik dalam penelitian ini maupun penelitian lainnya) telah mengganggu mikrobioma usus, dengan hampir secara eksklusif taksa non-inti (Li et al., 2015 ; Villabona et al., 2023 ). Pola ini tampaknya tersebar luas di seluruh spesies lebah dan lokasi pengambilan sampel, yang menunjukkan perlunya memahami peran bakteri usus non-inti dalam kesehatan lebah.
Percobaan laboratorium menunjukkan bahwa mikrobioma usus inti memberikan ketahanan kolonisasi terhadap bakteri usus non-inti fokal ( Serratia ). Inokulasi dengan simbion inti mengurangi kelimpahan absolut (dinilai dari jumlah CFU) dan relatif (dinilai dari sekuens gen 16S rRNA) Serratia . Sebelumnya, fungsi utama mikrobioma usus inti yang diketahui pada lebah adalah mengurangi infeksi oleh patogen eukariotik Crithidia (Koch & Schmid-Hempel, 2011b , 2012 ; Mockler et al., 2018 ). Kami menunjukkan bahwa perlindungan dari kolonisasi Serratia , fungsi mikrobioma inti yang didokumentasikan pada lebah madu (Lang et al., 2022 ; Steele et al., 2021 ), dilestarikan pada lebah. Dengan demikian, stresor yang mengganggu mikrobioma inti (misalnya agrokimia; Motta et al., 2018 ) dapat membuat lebah rentan terhadap infeksi patogen oportunistik. Meskipun mekanisme perlindungannya tidak jelas, simbion usus inti lebah madu diketahui dapat mengubah lingkungan fisikokimia dalam usus (Zheng et al., 2017 ) dan meningkatkan ekspresi gen imun (Kwong, Mancenido, et al., 2017 ). Beberapa bakteri usus inti lebah membentuk biofilm pada dinding usus belakang (Hammer, Le, Martin, et al., 2021 ), yang menciptakan penghalang fisik yang juga dapat menghambat kolonisasi.
Kami menemukan bahwa lebah kurang rentan terhadap kolonisasi Serratia ketika terpapar kemudian setelah kemunculan dewasa, yang menunjukkan bahwa jendela kolonisasi untuk bakteri non-inti menyempit saat inangnya dewasa. Hal ini sebagian dapat dijelaskan oleh suksesi mikrobioma usus inti selama awal masa dewasa (Hammer et al., 2023 ). Namun, tidak ada interaksi yang terdeteksi antara pengobatan mikrobioma usus inti dan waktu inokulasi dalam penelitian ini, yang menunjukkan bahwa pergeseran resistensi inang terhadap kolonisasi Serratia terjadi secara independen dari perubahan mikrobioma usus inti. Seiring bertambahnya usia pekerja, mereka dapat mengembangkan kekebalan endogen dan pertahanan penghalang yang lebih kuat di usus (Hammer et al., 2023 ), yang mungkin berkontribusi pada peningkatan resistensi kolonisasi.
Kami menemukan bahwa diet serbuk sari memengaruhi kolonisasi Serratia , meskipun dengan cara yang tidak terduga. Kolonisasi tertinggi dengan serbuk sari polifloral, menengah dengan bunga matahari monofloral dan terendah dengan serbuk sari soba monofloral. Sebaliknya, serbuk sari bunga matahari secara dramatis mengurangi infeksi B. impatiens oleh patogen eukariotik Crithidia bombi relatif terhadap lebah yang diberi makan soba atau serbuk sari bunga liar campuran (Figueroa, Fowler, et al., 2023 ; Fowler et al., 2022 ). Efek ini didorong oleh duri pada eksin serbuk sari bunga matahari, yang menghambat perlekatan C. bombi ke usus belakang lebah (Figueroa, Sadd, et al., 2023 ), berpotensi dengan mempercepat transit usus (Giacomini et al., 2022 ). Temuan kami menunjukkan bahwa efek penghambatan ini tidak meluas ke bakteri. Komposisi nutrisi atau kimia serbuk sari mungkin memainkan peran yang lebih penting. Baik serbuk sari bunga matahari maupun buckwheat memiliki kandungan protein yang rendah (Nicolson & Human, 2013 ; Yang et al., 2013 ), dan nutrisi yang buruk dapat mengganggu kekebalan lebah (Roger et al., 2017 ). Meskipun diet monofloral dengan kandungan protein rendah dapat diharapkan untuk mengurangi pertahanan imun dan meningkatkan kolonisasi patogen (Brunner et al., 2014 ; Castelli et al., 2020 ), kami menemukan pola yang berlawanan. Pertumbuhan Serratia mungkin bergantung pada status nutrisi inang, yang kami harapkan lebih rendah pada diet monofloral. Pekerjaan sebelumnya pada lebah dan lebah madu telah menunjukkan bahwa pembatasan nutrisi serbuk sari mengurangi infeksi oleh patogen eukariotik (Conroy et al., 2016 ; Logan et al., 2005 ). Sebagai alternatif, metabolit sekunder dalam serbuk sari buckwheat (misalnya fenolik; Nešović et al., 2020 ) dapat secara langsung menghambat Serratia . Walaupun mekanismenya tidak jelas, temuan kami menunjukkan bahwa makanan berperan dalam memfasilitasi atau menghambat kolonisasi bakteri non-inti pada lebah.
Studi kami juga menunjukkan bahwa bakteri non-inti dapat bertindak sebagai patogen lebah bumblebee yang oportunistik. Serratia mengurangi kelangsungan hidup lebah bumblebee dan, sebagai hasilnya, juga mengurangi total hasil reproduksi mikrokoloni, sejalan dengan temuan sebelumnya bahwa Serratia adalah patogen generalis (Burritt et al., 2016 ; Raymann et al., 2018 ). Bakteri non-inti lainnya pada lebah bumblebee liar, termasuk Pectobacterium, Arsenophonus, Klebsiella dan Leuconostoc , dapat memiliki efek parasit atau patogen pada serangga (Basset et al., 2000 ; Hiebert et al., 2020 ; Insua et al., 2013 ; Wilkes et al., 2012 ), yang menunjukkan bahwa mereka mungkin memainkan peran serupa pada lebah bumblebee. Ini penting, karena penelitian tentang patogen bakteri telah diidentifikasi sebagai prioritas mendesak untuk manajemen dan konservasi lebah (Figueroa, Sadd, et al., 2023 ). Karena bakteri usus non-inti sangat umum, mereka muncul bersamaan dengan stresor biotik dan abiotik lainnya (misalnya patogen eukariotik, pestisida, kurangnya sumber daya bunga), dengan potensi efek gabungan (Braglia et al., 2024 ). Oleh karena itu, kita harus memperdalam pemahaman kita tentang ekologi bakteri usus non-inti dan pengaruhnya terhadap kesehatan inang. Meskipun tidak semua bakteri non-inti kemungkinan bersifat patogen, ada kebutuhan untuk menilai secara lebih luas bagaimana bakteri non-inti memengaruhi kesehatan lebah, baik pada tingkat individu maupun koloni.
Galur Serratia yang digunakan dalam percobaan kami awalnya diisolasi dari lebah madu (Raymann et al., 2018 ; Steele et al., 2021 ). Fakta bahwa ia mudah menjajah lebah di laboratorium menunjukkan bahwa patogen ini dapat ditularkan antar spesies lebah dan mungkin antara populasi yang dikelola dan liar. Penularan patogen antarspesies menghadirkan tantangan besar bagi konservasi lebah, tetapi hampir semua penelitian tentang spillover patogen lebah difokuskan pada parasit dan virus eukariotik (Dalmon et al., 2021 ; Murray et al., 2013 ; Otterstatter & Thomson, 2008 ). Studi ini menunjukkan bahwa kita juga harus mempertimbangkan spillover patogen bakteri.
Singkatnya, kami telah menunjukkan bahwa bakteri usus lebah non-inti mencakup patogen oportunistik yang keberhasilan kolonisasinya bergantung pada waktu inokulasi, mikrobioma usus inti, dan pola makan. Hal ini memiliki implikasi konservasi dan pertanian yang signifikan, karena pemantauan dan penargetan patogen bakteri non-inti lebah mungkin penting untuk manajemen. Pekerjaan di masa mendatang dapat mengevaluasi apakah prevalensi bakteri non-inti merupakan indikator yang berguna untuk kesehatan populasi lebah liar. Efek pestisida atau pemicu stres lainnya pada mikrobioma usus inti dan patogen bakteri harus dievaluasi. Mempromosikan mikrobioma usus inti, melalui probiotik atau menanam bunga liar tertentu, dapat menjadi strategi untuk meningkatkan ketahanan lebah terhadap patogen. Akhirnya, dengan menunjukkan bahwa mikrobioma usus lebah inti memberikan ketahanan terhadap patogen bakteri oportunistik, pekerjaan ini juga berkontribusi pada pemahaman kita tentang ekologi mikrobioma usus pada lebah sosial.
