Abstrak
Rangka aksial post-kranial teleostean adalah struktur yang sangat terspesialisasi untuk cara hidup akuatik. Namun, pengetahuan mengenai kontribusi parental, dampak lingkungan awal kehidupan terhadap variasi meristiknya dan apakah heterozigositas yang tereduksi menghambat perkembangannya masih terbatas. Untuk mengatasi hal ini, penelitian saat ini menggunakan galur homozigot dan heterozigot isogenik salmon Atlantik ( Salmo salar ) yang dikombinasikan dengan manipulasi ploidi (triploidisasi) untuk memanipulasi kontribusi parental, dan suhu inkubasi (4 vs. 8°C) sebagai variabel awal kehidupan, dan membesarkan ikan hingga ~150 g untuk pemeriksaan radiologis terperinci. Ikan yang identik secara genetik diinkubasi pada suhu 4°C, tetapi tidak pada suhu 8°C, dipisahkan menjadi dua mode ukuran (atas/bawah), yang berbeda dalam jumlah lepidotrich sirip punggung dan ekor serta jumlah pterigiofor sirip dubur. Suhu inkubasi tidak berdampak pada jumlah vertebra, sedangkan inkubasi 8°C menghasilkan lebih banyak supraneural daripada inkubasi 4°C. Setelah inkubasi 8°C, diploid homozigot (100% kromosom maternal) dan triploid heterozigot (67% kromosom maternal) mengembangkan jumlah total vertebra dan jumlah pterigiofor sirip punggung dan dubur yang lebih rendah daripada diploid heterozigot (50% kromosom maternal). Untuk lepidotrich sirip ekor, kelompok yang sama menunjukkan pola berikut: diploid heterozigot > triploid heterozigot > diploid homozigot. Diploid homozigot mengembangkan tingkat fusi lengkap yang tinggi di kolom vertebra. Hasil penelitian saat ini menunjukkan bahwa kemampuan untuk memasuki mode pertumbuhan yang berbeda bergantung pada suhu inkubasi embrio dan dapat dikontrol oleh mekanisme epigenetik. Lebih jauh, hasil penelitian menunjukkan efek dosis maternal yang kuat pada jumlah lepidotrich sirip ekor, sedangkan untuk bagian rangka pasca-kranial lainnya, keberadaan kromosom maternal ekstra tampaknya mengesampingkan kontribusi paternal. Temuan tersebut mungkin mencerminkan adaptasi evolusioner untuk pembentukan fenotipe keturunan. Mekanisme tersebut akan berdampak pada sifat-sifat penting yang terkait dengan kebugaran, seperti kemampuan berenang dan kesuburan, yang relevan untuk konservasi dan biologi evolusioner serta ilmu ekologi dan akuakultur. Kelainan bentuk tulang belakang yang berkembang pada ikan homozigot tampaknya didukung oleh mekanisme perbaikan aktif, yang mungkin mencerminkan kemampuan organisme untuk mengurangi biaya perkawinan sedarah.
1. PENDAHULUAN
Rangka aksial post-kranial ikan teleost tersusun atas tulang belakang, supraneural, dan sirip median (tidak berpasangan) (sirip punggung, dubur, dan ekor). Struktur pertama yang terbentuk adalah notochord (Witten & Hall, 2022 ) diikuti oleh perkembangan bagian-bagian rangka (Gwyn, 1940 ). Pada salmon Atlantik Salmo salar L. 1758, notochord hadir sejak 110 derajat-hari (d o ) pasca-fertilisasi, dan elemen rangka aksial post-kranial pertama yang terbentuk adalah lepidotrichia sirip punggung dan dubur, bersama dengan hypurals sirip ekor (Kryvi et al., 2017 ). Selanjutnya, bagian-bagian kerangka yang tersisa dibentuk secara berurutan, dan semua bagian hadir pada 750 hari ( Kryvi et al., 2017 ), yang sesuai dengan titik waktu ketika alevin meninggalkan kerikil pelindung dan berenang ke permukaan untuk mengisi kantung renang dan memulai pemberian makan eksogen (Crisp, 1988 ; Tait, 1960 ).
Ada beberapa variasi dalam jumlah elemen yang terbentuk dalam setiap bagian rangka aksial post-kranial pada salmon Atlantik (Mottley, 1937 ; Sanford, 2000 ), tetapi implikasi fungsional yang mungkin tidak diketahui. Namun, ada penelitian pada teleost lain yang menunjukkan bahwa jenis variasi meristik ini dapat memengaruhi sifat-sifat penting yang terkait dengan kebugaran, seperti kesuburan ( Rutilus rutilus L. 1758) (Komova, 2023 ), kelangsungan hidup predator ( Gasterosteus aculeatus L. 1758) (Swain, 1992a , 1992b ), bentuk tubuh ( Galaxias plate Steindachner, 1898) (Barriga et al., 2013 ) dan kinerja melarikan diri ( Salvelinus alpinus L. 1758) (Campbell et al., 2021 ).
Beberapa faktor dapat memengaruhi variasi meristik dalam rangka aksial post-kranial pada teleost. Suhu air selama perkembangan embrio telah lama dikenal sebagai faktor penting (Hubbs, 1922 ; Jordan, 1891 ). Misalnya, pada salmonid, jumlah vertebra berbanding terbalik dengan laju perkembangan, sehingga meningkat pada suhu inkubasi telur yang lebih rendah (Beacham & Murray, 1986 ; Garside, 1966 ; Kwain, 1975 ; Lindsey et al., 1984 ). Baru-baru ini, De Clercq et al. ( 2018 ) tidak menemukan perbedaan dalam jumlah total vertebra antara salmon Chinook ( Oncorhynchus tshawytscha , Walbaum 1792) yang diinkubasi pada suhu 8 atau 12°C, sedangkan jumlah vertebra di daerah vertebra tertentu berbeda antara kedua suhu tersebut. Demikian pula, perbedaan regional yang disebabkan oleh suhu dalam jumlah vertebra juga telah dilaporkan di Astyanax mexicanus De Filippi, 1853 (Reyes Corral & Aguirre, 2019 ). Fraser et al. ( 2015 ) menemukan jumlah vertebra total yang lebih tinggi pada salmon Atlantik yang diinkubasi pada 6 dan 8 °C dibandingkan dengan yang diinkubasi pada 10 °C, tetapi tidak ada perbedaan yang diamati antara 6 dan 8 °C. Studi itu tidak menyelidiki kemungkinan perbedaan regional dalam tulang belakang, dan tidak diketahui apakah penurunan lebih lanjut dari suhu inkubasi dan laju perkembangan ke tingkat yang lebih alami akan menghasilkan jumlah vertebra yang lebih tinggi. Saat ini, petani salmon Atlantik biasanya menggunakan suhu stabil 8 °C untuk mempercepat perkembangan, yang jauh di luar kisaran termal alami pada tahap kehidupan ini. Di alam, salmon Atlantik liar bertelur pada bulan November dan Desember pada suhu rendah, dengan embrio yang sedang berkembang mengalami suhu rata-rata 4,5°C (minimum 2,2°C dan maksimum 8,2°C) sebelum menetas (Jonsson & Jonsson, 2018 ).
Faktor lain yang dapat memengaruhi meristik rangka aksial pasca-kranial adalah susunan genetik ikan. Sebagai contoh, dan terkait dengan faktor suhu yang diperkenalkan sebelumnya, Ali dan Lindsey ( 1974 ) mempelajari meristik rangka aksial pasca-kranial yang diwariskan dan yang diinduksi suhu pada ikan medaka ( Oryzias latipes Temminck & Schlegel, 1846) dan menemukan bahwa variasi yang diwariskan dalam suhu yang berbeda sama dengan variasi fenotipik di antara keduanya. Demikian pula, variasi antar keluarga dalam jumlah total vertebrae setelah suhu inkubasi telur yang sama telah dilaporkan pada beberapa spesies salmonid, seperti salmon masu ( Oncorhynchus masou Brevoort, 1856) (Ando et al., 2008 ), salmon chum ( Oncorhynchus keta Walbaum 1792) (Ando et al., 2011 ), ikan trout pelangi ( Oncorhynchus mykiss Walbaum 1792) (Mottley, 1937 ) dan ikan trout coklat ( Salmo trutta L. 1758) (Schmidt, 1919 ). Induksi triploidi telah lama digunakan dalam akuakultur salmonid untuk menghasilkan ikan steril fungsional untuk mengurangi masalah yang terkait dengan kualitas daging yang berkurang akibat pematangan seksual dini atau introgresi genetik yang disebabkan oleh perkawinan silang antara ikan budidaya yang lolos dan ikan liar (Benfey, 2001 ; Benfey, 2016 ; Fraser et al., 2012 ). Susunan genetik triploid diubah oleh set kromosom maternal tambahan (Glover et al., 2015 ), dan jumlah total vertebra dilaporkan lebih rendah pada triploid dibandingkan dengan salmon Atlantik diploid ( S. salar L. 1758) (Fraser et al., 2015 ).
Dengan menghilangkan komponen genetik dari variasi fenotipik, galur ikan klonal dapat digunakan untuk menyempurnakan studi tentang kemungkinan suhu, pewarisan, dan variasi meristik yang diinduksi ploidi dalam rangka aksial pasca-kranial (Nakajima et al., 1996 ; Taniguchi et al., 1996 ). Baru-baru ini, protokol telah ditetapkan untuk menghasilkan galur betina haploid ganda homozigot (Hansen et al., 2020 ) dan jantan (Fjelldal et al., 2020 ) dari salmon Atlantik, yang memungkinkan produksi galur hibrida heterozigot isogenik. Membandingkan klon homozigot diploid dengan saudara tiri heterozigot diploid dan triploidnya merupakan pendekatan yang belum dieksplorasi untuk memperluas pengetahuan tentang kontribusi parental terhadap variasi meristik, dan bagaimana set kromosom maternal tambahan triploid dapat berinteraksi.
Ploidi dan suhu inkubasi juga dapat memengaruhi perkembangan deformitas vertebra pada ikan, bukan hanya variasi meristik. Penilaian deformitas juga relevan untuk penelitian yang melibatkan ikan klonal, karena tingkat deformitas meningkat setelah perkawinan sedarah (Kerniske et al., 2021 ; Winemiller & Taylor, 1982 ). Pada salmon Atlantik triploid, lokasi dominan untuk deformitas berada pada vertebra nomor 24 di bagian posterior daerah perut (Fjelldal & Hansen, 2010 ; Sankar, Kryvi, et al., 2024 ), tetapi lokasi kemungkinan perkawinan sedarah/deformitas vertebra spesifik klonal belum dieksplorasi. Mengenai suhu inkubasi, suhu standar industri sebesar 8°C untuk salmon Atlantik diploid tidak mendukung perkembangan normal tulang belakang pada triploid, tetapi menurunkan suhu inkubasi hingga 6°C membantu meringankan masalah (Fraser et al., 2015 ). Meningkatkan jumlah fosfor anorganik ke dalam makanan juga mengurangi risiko perkembangan deformitas lebih lanjut (Fjelldal et al., 2016 ), dengan periode pemberian makan pertama menjadi yang paling kritis (Sambraus et al., 2020 ).
Berbagai metode telah digunakan untuk menghitung vertebra spesifik wilayah pada teleost. Pada salmonid, jumlah vertebra spesifik wilayah telah ditentukan baik dengan mengukus dan membuang kolom vertebra (salmon masu, Ando et al., 2008 ) atau histologi (salmon Chinook, De Clercq et al., 2017 ). Metode-metode ini memakan waktu, sehingga mengurangi kepraktisannya. Namun, Sankar, Kryvi, et al. ( 2024 ) baru-baru ini mengembangkan metode regionalisasi baru untuk kolom vertebra pada salmonid berdasarkan ciri-ciri radiografi spesifik. Metode ini memungkinkan penghitungan vertebra yang akurat pada wilayah pasca-kranial, abdomen, transisional, kaudal, dan ural dari kolom vertebra pada masing-masing ikan.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji (i) dampak suhu inkubasi 4°C (kisaran alami) versus 8°C (standar industri) pada variasi meristik, (ii) dampak maternal versus paternal dan efek penggandaan kontribusi kromosom maternal melalui triploidi pada variasi meristik, (iii) kemungkinan perbedaan fenotipe deformitas vertebra antara klonal salmon Atlantik triploid dan diploid. Galur klonal homozigot dan heterozigot salmon Atlantik digunakan. Penelitian ini penting untuk memahami pembentukan fenotipe keturunan dalam konsep adaptasi evolusioner dan adaptasi lokal, serta kemampuan organisme untuk menangkal kemungkinan cacat rangka yang disebabkan oleh perkawinan sedarah.
2 BAHAN DAN METODE
Gambar 1 merangkum set-up eksperimen. Singkatnya, penelitian ini menggunakan sel telur dari satu betina homozigot haploid ganda XX yang dibuahi dengan sperma yang diradiasi ultraviolet (UV) (untuk menghasilkan garis homozigot isogenik) atau sperma yang dikriopreservasi dari super jantan YY homozigot haploid ganda (untuk menghasilkan garis heterozigot isogenik). Setelah itu, semua sel telur yang dibuahi dengan sperma yang diradiasi UV dan setengah dari sel telur yang dibuahi dengan sperma YY mengalami tekanan hidrostatik untuk menghasilkan klon homozigot diploid semua betina (sperma yang diradiasi UV) atau klon heterozigot triploid semua jantan (sperma YY). Setengah sel telur yang tersisa yang dibuahi dengan sperma YY tidak mengalami kejutan tekanan dan menghasilkan klon heterozigot diploid semua jantan. Selama inkubasi telur, semua kelompok diinkubasi pada suhu 8°C, tetapi beberapa ikan heterozigot diploid juga diinkubasi pada suhu 4°C untuk membuat kelompok tambahan. Triploid diinkubasi pada suhu 8°C dan pertama-tama diberi makan dengan diet diploid normal untuk meningkatkan deformitas guna memungkinkan perbandingan dengan kemungkinan deformitas spesifik garis klonal. Setelah ini, ikan dipelihara hingga ~150 g untuk memungkinkan pemeriksaan radiologis terperinci.
Catatan tentang faktor pengganggu : Tidak ada kelompok homozigot triploid, dan ikan homozigot semuanya betina, sedangkan ikan heterozigot semuanya jantan. Ini adalah satu-satunya pilihan dengan pendiri homozigot XX dan YY yang tersedia saat ini.
2.1 Pengaturan percobaan
Telur dari ikan salmon Atlantik betina haploid ganda dibagi menjadi empat kelompok yang masing-masing berisi sekitar 2000 telur. Satu kelompok telur dibuahi dengan sperma yang diencerkan (1:40) dan disinari UV dan diberikan kejutan tekanan selama 5 menit pada tekanan 655 bar pada suhu 300 derajat (min°C) pasca-fertilisasi (pembelahan meiosis kedua), yang menghasilkan produksi kelompok betina homozigot diploid (XX) (Hansen et al., 2020 ). Kelompok ini diinkubasi pada suhu 8°C (DHo 8°C). Tiga kelompok telur lainnya dibuahi dengan sperma kriopreservasi dari super jantan haploid ganda (YY) (Fjelldal et al., 2020 ), menghasilkan produksi hibrida heterozigot semua jantan (XY), yang dibagi menjadi tiga kelompok terpisah: Dua kelompok diinkubasi pada suhu 4°C (DHt 4°C) atau 8°C (DHt 8°C) sebagai kelompok heterozigot diploid. Satu kelompok yang tersisa mengalami kejutan tekanan selama 5 menit pada 655 bar pada 300 menit°C (pembelahan meiosis kedua) pasca-fertilisasi untuk menghasilkan kelompok heterozigot semua jantan (XXY) triploid. Kelompok ini diinkubasi pada suhu 8°C (THt 8°C). Semua kelompok diberi makan dengan diet komersial (Skretting AS).
Selama pertumbuhan air tawar, jelas bahwa kelompok DHt 4°C mengembangkan distribusi ukuran bimodal yang jelas, yang normal untuk salmon Atlantik outbred yang dibesarkan pada intensitas rendah (Thorpe, 1977 ). Oleh karena itu, kelompok perlakuan selanjutnya dibagi lagi menjadi kelompok besar (DHtL 4°C) dan kecil (DHtS 4°C) untuk menguji kemungkinan perbedaan antara fenotipe (Gambar 2 ). Ikan pertama kali diberi makan di bawah cahaya terus menerus dan 12°C stabil (air panas), di mana waktu pemberian makan pertama ditunda selama 3 bulan pada ikan yang diinkubasi pada suhu 4°C. Ketika suhu air tawar alami mencapai 12°C pada akhir Juni, suhu alami dipertahankan. Setelah ini, ikan dibesarkan di bawah cahaya terus menerus dan suhu alami di air tawar hingga ~150 g berat badan, yang memungkinkan pemeriksaan radiologis terperinci untuk meristik rangka aksial post-kranial dan deformitas vertebra.
2.2 Pengambilan sampel
Kelima kelompok (DHo 8°C, DHt 8°C, THt 8°C, DHtL 4°C, dan DHtS 4°C) diambil sampelnya untuk 16 ekor ikan dan diukur panjang dan berat tubuhnya serta diradiografi untuk menganalisis jumlah meristik rangka aksial post-kranial dan deformitas vertebra. Selain itu, sirip adiposa dipotong untuk analisis DNA mikrosatelit guna mengonfirmasi status klonal, ploidi, dan zigositas.
2.3 Diseksi, radiologi, hitungan meristik dan deformitas vertebra
Tulang belakang dan sirip dari setiap spesimen dibedah dan diradiografi. Pertama, sirip punggung dan sirip dubur – lepidotrich dan pterygiophores – dibedah bebas dari tulang belakang dan diradiografi (Amos et al., 1963 ). Kemudian tulang belakang diradiografi dengan lepidotrich sirip ekor. Radiografi diambil menggunakan sistem radiologi langsung (resolusi: 4.0 Ip/mm, CANON CXDI410C Wireless, CANON INC, Kawasaki, Jepang) dan unit sinar-X portabel (unit sinar-X portabel Hiray Plus, Model Porta 100 HF, Job Corporation, Jepang) dengan input 40 kV dan 4 mA pada jarak 88 cm. Gambar TIF digital dianalisis untuk jumlah tulang belakang spesifik wilayah, dan jumlah supraneural, lepidotrich sirip, dan pterygiophores. Daerah tulang belakang diidentifikasi berdasarkan ciri-ciri radiografi yang dijelaskan oleh Sankar, Kryvi, dkk. ( 2024 ), yang memungkinkan penghitungan vertebra spesifik daerah dalam daerah pasca-kranial, abdomen, transisional, kaudal, dan ural tulang belakang. Deformitas vertebra yang diamati di setiap daerah vertebra diklasifikasikan berdasarkan fenotipe yang dijelaskan dalam Witten dkk. ( 2009 ).
2.4 Konfirmasi verifikasi isogenik, zigositas dan ploidi
Analisis DNA mikrosatelit dilakukan pada sirip adiposa yang diambil sampelnya untuk mengonfirmasi status isogenik, zigositas, dan ploidi. Total DNA diekstraksi dari potongan sirip menggunakan kit ekstraksi yang tersedia secara komersial (Qiagen DNeasy 96 Blood & Tissue Kit). Sembilan belas penanda DNA mikrosatelit digenotipe menggunakan protokol isolasi dan amplifikasi standar yang sebelumnya dijelaskan secara rinci (Glover et al., 2015 ; Wennevik et al., 2019 ).Individu diklasifikasikan sebagai heterozigot atau homozigot berdasarkan ada atau tidaknya dua alel untuk berbagai mikrosatelit yang dinilai. Triploidi dapat disimpulkan dari amplifikasi yang lebih tinggi pada alel-alel yang digandakan (Delaval et al., 2024 ).
2.5 Perhitungan dan analisis statistik
Faktor kondisi (CF) dihitung sebagai CF = 100 × BW/L 3 , di mana BW adalah berat badan (g), dan L adalah panjang garpu (cm).Data ditransfer ke perangkat lunak Statistik R (versi 4.0.4, Tim Inti R, 2021 ) untuk semua analisis. Paket ‘MASS’ (Venables & Ripley, 2002 ), ’emmeans’ (Lenth, 2021 ), dan ‘ggplot2’ (Wickham, 2016 ) digunakan untuk analisis dan penyajian grafis. Secara keseluruhan, diagnostik model dinilai melalui plot qq dan plot residual terstandarisasi versus terprediksi. Data mentah (Sankar JFB.RData) dan skrip R yang digunakan untuk analisis (Sanker JFB.R) tersedia dalam materi tambahan.
Untuk menilai efek genetik, baik model regresi logistik peluang proporsional (POLR) atau model linear umum (GLM) dengan distribusi binomial (ketika titik akhir hanya memiliki dua hasil) dipasangkan pada jumlah total vertebra dan data sirip lepidotrichs dan pterygiophores dari kelompok DHt 8°C, DH 8°C dan THt 8°C (lihat Tabel 1 ). Perbedaan kelompok pada panjang, berat dan kondisi dinilai oleh GLM, prevalensi ikan cacat dinilai oleh GLM dalam distribusi binomial (cacat; ya/tidak) dan jumlah vertebra cacat per ikan cacat dinilai oleh GLM. Untuk menilai suhu inkubasi dan efek fenotipe ukuran, pendekatan yang sama digunakan untuk data dari kelompok DHt 8°C, DHtL 4°C dan DHtS 4°C meskipun uji Kruskal–Wallis digunakan untuk menilai jumlah vertebra yang cacat per ikan yang cacat karena data sangat miring ke kanan. Untuk menilai perbedaan prevalensi fenotipe deformitas, kami menggunakan model POLR. Untuk membantu analisis, fenotipe deformitas vertebra dikelompokkan menjadi kompresi (fenotipe 2 dan 5), fusi tidak stabil (fenotipe 6 dan 8) dan fusi stabil (fenotipe 7), yang menghasilkan tiga level.
3 HASIL
Analisis mikrosatelit mengonfirmasi bahwa semua ikan yang diambil sampelnya bersifat isogenik dan memiliki ploidi dan zigositas yang benar sesuai dengan kelompoknya (Hvas et al., 2025 sedang ditinjau). Secara khusus, semua individu dalam kelompok memiliki alel yang sama (pengulangan DNA), dan ikan heterozigot memiliki dua alel yang berbeda, sedangkan ikan homozigot hanya memiliki satu alel untuk setiap penanda. Sementara itu, triploidi disimpulkan dari amplifikasi alel maternal yang lebih tinggi (Delaval et al., 2024 ).
3.1 Inkubasi pada suhu 4 vs 8°C
Ada perbedaan signifikan dalam jumlah lepidotrich sirip punggung dan ekor dan pterygiophore sirip dubur antara kelompok DHtL 4°C dan DHtS 4°C (Gambar 3 ; Tabel 1 ). Dengan demikian, ini dianggap sebagai kelompok terpisah dalam perbandingan untuk efek suhu inkubasi pada karakter meristik (DHtS 4°C vs. DHtL 4°C vs. DHt 8°C). Panjang rata-rata, berat dan faktor kondisi ditunjukkan pada Tabel 1 . Kelompok DHtS 4°C memiliki berat dan panjang yang secara signifikan lebih rendah daripada kelompok DHtL 4°C dan DHt 8°C, dan faktor kondisi yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok DHtL 4°C (Tabel 1 ). Gambar 2 adalah histogram yang menunjukkan distribusi berat kelompok DHtS 4°C dan DHtL 4°C.
Kelompok DHt 8°C memiliki supraneural dan lepidotrich sirip ekor yang secara signifikan lebih banyak dibandingkan dengan DHtS 4°C, tetapi tidak pada kelompok DHtL 4°C, sedangkan untuk sirip dubur, kelompok DHt 8°C memiliki pterigiofor yang secara signifikan lebih sedikit daripada kelompok DHtL 4°C, tetapi tidak pada kelompok DHtS 4°C (Gambar 3 ; Tabel 1 ). Kelompok DHt 8°C tidak berbeda dari kelompok 4°C untuk jumlah lepidotrich sirip punggung, sedangkan kelompok DHtS 4°C memiliki jumlah yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok DHtL 4°C (Gambar 3 ; Tabel 1 ). Frekuensi dan tingkat keparahan deformitas vertebra tidak berbeda secara signifikan antara kelompok-kelompok (Tabel 1 ; Gambar 4 ), meskipun ada efek kelompok yang signifikan terhadap prevalensi fenotipe deformitas dengan DHtL 4°C yang memiliki fusi yang lebih stabil (fenotipe 7), sedangkan kelompok DHtS 4°C dan DHt 8°C memiliki lebih banyak kompresi (fenotipe 2 dan 5) dan fusi yang tidak stabil (fenotipe 6 dan 8).
3.2 Kelompok berbeda diinkubasi pada suhu 8°C
Kelompok DHo 8°C, DHt 8°C, dan THt 8°C semuanya mengembangkan distribusi ukuran yang seragam, dan tidak ada perbedaan dalam panjang, berat, atau faktor kondisi di antara mereka (Tabel 1 ). Ada efek kelompok yang signifikan pada jumlah vertebra total dan regio kaudal, dan kelompok DHo 8°C dan THt 8°C memiliki jumlah vertebra total yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok DHt 8°C (Tabel 1 ), yang terutama dikaitkan dengan lebih banyak vertebra kaudal pada kelompok yang terakhir (Gambar 3 ). Demikian pula, untuk pterigiofor sirip punggung dan sirip dubur, ada efek kelompok yang signifikan, karena kelompok DHo 8°C dan THt 8°C memiliki jumlah yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok DHt 8°C (Tabel 1 ; Gambar 3 ). Terdapat pula pengaruh kelompok yang signifikan terhadap jumlah lepidotrich pada sirip punggung dan ekor, dan kelompok THt 8°C mempunyai jumlah yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok DHt 8°C dan DHo 8°C untuk sirip punggung, sedangkan kelompok DHt 8°C mempunyai jumlah yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok DHo 8°C untuk sirip ekor, dengan kelompok THt 8°C menampilkan jumlah yang menengah (Tabel 1 ; Gambar 3 ).
Frekuensi ikan dengan deformitas vertebra, bagaimanapun, secara signifikan lebih tinggi pada kelompok DHo dan THt dibandingkan dengan kelompok DHt (Tabel 1 ; Gambar 4 ). Tingkat keparahan deformitas sama antara kelompok, dan jumlah vertebra yang cacat di antara ikan yang terkena berkisar antara 7,5 dan 9,3 (Tabel 1 ; Gambar 4 ). Namun, lokasi deformitas dan prevalensi fenotipe berbeda antara kelompok DHo dan THt. Lokasi dominan untuk deformitas berada di bagian tengah daerah perut, dengan vertebra nomor 16 paling sering terkena pada kelompok DHo, sedangkan itu berada di perbatasan antara daerah perut dan transisi, dengan vertebra nomor 27 paling sering terkena pada kelompok THt (Gambar 4 ). Selain itu, kelompok THt memiliki puncak deformitas yang lebih kecil di area yang sama dengan puncak utama pada kelompok DHo, dan kedua kelompok memiliki puncak deformitas yang lebih kecil di bagian posterior daerah ekor (Gambar 4 ). Di tengah-tengah puncak deformitas utama (DHo V15–17 vs. THt V26–28), distribusi tipe deformitas (T) adalah sebagai berikut: DHo (T2 < T8 < T6 < T7) (4,3%, 9,7%, 23,7%, 62,3%) dan THt (T7 < T8 < T5 < T6) (15,2%, 19,2%, 27,2%, 38,4%). Secara keseluruhan, kompresi (fenotipe 2 dan 5) dan fusi tidak stabil (fenotipe 6 dan 8) mendominasi kelompok DHt dan THt, sedangkan fusi stabil (fenotipe 7) merupakan tipe deformitas dominan pada kelompok DHo
4 DISKUSI
Hasil penelitian ini menunjukkan beberapa efek pada jumlah meristik dalam rangka aksial pasca-kranial, baik antara fenotipe dalam keluarga maupun antara suhu inkubasi dan ploidi. Selain itu, fenotipe deformitas tulang belakang berbeda pada galur heterozigot triploid dibandingkan dengan galur homozigot diploid, baik berkenaan dengan lokasi maupun jenis deformitas.
4.1 Fenotipe dan suhu inkubasi mempengaruhi jumlah meristik
Hibrida isogenik diploid (DHt) yang diinkubasi pada suhu 4°C mengembangkan distribusi bimodal yang jelas dalam ukuran, yang tidak diamati setelah inkubasi pada suhu 8°C. Ini bisa dianggap mengejutkan, karena mode tersebut mengandung hibrida isogenik yang identik secara genetik. Perkembangan bimodalitas adalah norma pada salmon Atlantik liar (Thorpe, 1977 ), yang memungkinkan keragaman dalam usia smolting dan kedewasaan (Simpson & Thorpe, 1976 ; Thorpe et al., 1982 ), dan mungkin memang mewakili perlindungan untuk keberhasilan reproduksi populasi liar. Susunan genetik ikan dan faktor lingkungan, seperti proporsi penutup yang tersedia, kecepatan air (diulas dalam Thorpe et al., 1982 ) dan fotoperiode (Skilbrei, 1991 ), dapat memengaruhi tingkat segregasi ke dalam mode ukuran pada salmon Atlantik. Perkembangan mode ukuran muncul pada tahap parr, pada panjang ‘ambang’ 7,5–8 cm (Skilbrei, 1988 ), di bawahnya sumbu ‘cahaya-hipofisis’ (Komourdjian et al., 1976 ) tidak berfungsi (Nordgarden et al., 2007 ). Studi terkini juga menunjukkan bahwa suhu inkubasi dan kecepatan perkembangan berdampak pada kemungkinan pemisahan ke dalam mode ukuran pada salmon Atlantik.
Ada kemungkinan juga bahwa suhu selama perkembangan embrio dapat mengatur mekanisme epigenetik yang memengaruhi sifat riwayat hidup yang berkembang selanjutnya pada ikan (Jonsson & Jonsson, 2014 , 2019 ). Inkubasi 4 °C berada dalam kisaran termal alami untuk embrio salmon Atlantik, sedangkan 8 °C lebih tinggi, dan Macqueen et al. ( 2008 ) menunjukkan bahwa suhu dalam periode dari pembuahan hingga tahap telur bermata memengaruhi fenotipe otot sepanjang hidup pada salmon Atlantik. Bagaimana perubahan struktural tersebut terkait dengan kemampuan ikan untuk memasuki fenotipe pertumbuhan yang berbeda, yang pada akhirnya memungkinkan variabilitas dalam smolting dan usia kedewasaan di alam, saat ini tidak diketahui. Dengan demikian, jalur biologis ini harus dieksplorasi lebih lanjut untuk menilai dampak perubahan iklim.
Pengamatan mengejutkan lainnya adalah perbedaan pada lepidotrich sirip punggung dan ekor, dan jumlah pterygiophore sirip dubur yang diamati antara mode ukuran pada suhu 4°C. Ini mungkin bukan karena susunan genetik ikan, karena semuanya identik secara genetik. Oleh karena itu, pengamatan saat ini mendukung gagasan Jonsson dan Jonsson ( 2014 , 2019 ) bahwa mekanisme epigenetik selama periode embrionik terlibat dalam pembentukan fenotipe di kemudian hari. Satu penjelasan yang masuk akal untuk pengamatan saat ini mungkin adalah bahwa ikan mode bawah dan atas memiliki tingkat perkembangan yang berbeda sebagai embrio, yang pada gilirannya memengaruhi pembentukan bagian-bagian tertentu dari kerangka aksial pasca-kranial. Lepidotrich sirip punggung dan ekor mulai terbentuk pada 370 d° setelah pembuahan, yang merupakan setelah tahap telur bermata (Kryvi et al., 2017 ). Arah pembentukannya adalah dua arah di kedua sirip dan dimulai di hypural 1 pada sirip ekor dan di ujung kranial pada sirip punggung (Sankar, Fraser, et al., 2025 ). Pterigiofor sirip dubur mulai terbentuk pada 400 d° di dekat ujung kranial sirip diikuti oleh urutan perkembangan dua arah ke arah kepala dan ekor (Kryvi et al., 2017 ; Sankar, Fraser, et al., 2025 ). Salah satu cara untuk mengeksplorasi kemungkinan hubungan antara kecepatan perkembangan dan fenotipe adalah dengan memeriksa apakah waktu penetasan mempengaruhi pertumbuhan selanjutnya dengan memisahkan saudara kandung yang menetas awal dan akhir.
Embrio yang diinkubasi pada 8°C umumnya memiliki lebih banyak supraneural daripada yang diinkubasi pada 4°C. Mode ukuran yang lebih tinggi pada 4°C adalah antara mode 8°C dan 4°C yang lebih rendah, tetapi 8°C memiliki rata-rata 13,5 supraneural, sedangkan mode 4°C yang lebih tinggi dan lebih rendah memiliki 12,7 dan 12,6, berturut-turut. Tren yang sama diamati oleh Beacham dan Murray ( 1986 ) yang menemukan penurunan jumlah jari-jari sirip punggung dengan penurunan suhu inkubasi pada ikan salmon chum ( O. keta Walbaum 1792). Ini adalah tren yang berlawanan yang diyakini ada untuk penentuan jumlah vertebra di mana penurunan suhu embrio seharusnya meningkatkan jumlah vertebra (Beacham & Murray, 1986 ; Garside, 1966 ; Kwain, 1975 ; Lindsey et al., 1984 ). Memang, penelitian saat ini tidak menunjukkan efek suhu pada jumlah total vertebra antara 4 dan 8 °C, serupa dengan pengamatan oleh Fraser et al. ( 2015 ) yang membandingkan 6 dan 8 °C. Lebih jauh, tidak ada efek suhu pada jumlah vertebra spesifik wilayah dalam penelitian saat ini, tidak seperti hasil penelitian sebelumnya yang menunjukkan jumlah vertebra yang berbeda dalam wilayah vertebra spesifik antara suhu inkubasi pada salmon Chinook ( O. tshawytscha , Walbaum 1792) (De Clercq et al., 2018 ) dan A. mexicanus De Filippi, 1853 (Reyes Corral & Aguirre, 2019 ). Satu-satunya bagian dari kerangka aksial pasca-kranial di mana suhu inkubasi rendah meningkatkan jumlah meristik adalah pterigiofor sirip dubur, di mana mode atas pada 4 °C menghasilkan jumlah tertinggi.
4.2 Triploidi menyebabkan efek maternal pada jumlah vertebra
Pada inkubasi 8°C, penelitian saat ini menunjukkan bahwa ikan heterozigot jantan-semuanya isogenik diploid dan triploid mengembangkan jumlah total vertebra dan jumlah pterigiofor sirip punggung dan dubur yang berbeda, sedangkan ikan homozigot diploid betina-semuanya isogenik mengembangkan jumlah yang sama seperti yang terakhir. Hasil triploidisasi saat ini kemungkinan besar mencerminkan efek dosis genetik dengan penambahan lebih banyak kromosom maternal, terutama karena triploid berkembang sama dengan kelompok homozigot betina-semuanya yang hanya memiliki kromosom maternal. Memang, jumlah vertebra yang berbeda antara salmon Atlantik diploid dan triploid (Fraser et al., 2015 ) dan ikan trout pelangi ( O. mykiss Walbaum 1792) (Kacem et al., 2004 ) telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya. Penelitian saat ini adalah yang pertama menunjukkan bahwa triploid jantan-semuanya mengembangkan jumlah vertebra yang sama dengan diploid betina-semuanya yang hanya memiliki kromosom maternal. Tidak seperti jumlah total vertebra dan hitungan pterigiofor sirip punggung dan dubur, di mana homozigot diploid dan heterozigot triploid mengembangkan hitungan yang sama, hitungan lepidotrich sirip ekor menunjukkan hubungan terdekat dengan dosis kromosom ibu: heterozigot triploid (dosis ibu 67%) memiliki rata-rata 40,8 lepidotrich, perantara antara heterozigot diploid (dosis ibu 50%) dengan 40,0 dan homozigot diploid (dosis ibu 100%) dengan 41,6. Dengan demikian, tampaknya untuk beberapa bagian kerangka pasca-kranial, setiap keberadaan kromosom ibu tambahan mengesampingkan kontribusi paternal, sedangkan untuk yang lain, efek dosis yang lebih jelas muncul. Meskipun demikian, model yang saat ini digunakan dengan ikan homozigot dan heterozigot isogenik tampaknya sangat cocok untuk mempelajari efek kromosom ibu tambahan pada fenotipe mereka.
Norma reaksi yang saat ini diamati terhadap ploidi juga telah diamati ketika mempelajari fenotipe eksternal hibrida diploid dan triploid yang dibuat dengan menyilangkan salmon Atlantik betina dan ikan trout coklat jantan ( S. trutta L. 1758), di mana hibrida triploid sama dengan induknya, dan hibrida diploid merupakan perantara antara spesies parental (Fraser et al., 2021 , 2022 ). Namun, hal ini tidak diamati oleh Fleming et al. ( 2014 ) yang membandingkan jumlah total vertebra, jumlah sisik di sepanjang gurat sisi, dan jumlah jari-jari sirip di sirip punggung antara hibrida diploid dan triploid salmon Atlantik betina dan ikan char Arktik jantan ( S. alpinus L. 1758). Dalam penelitian mereka, jumlah total vertebra dan jari-jari sirip punggung hibrida triploid serupa dengan ikan char Arktik diploid, sedangkan jumlah sisik serupa dengan ikan salmon Atlantik diploid. Para penulis menyarankan kontribusi genetik mosaik dari spesies induk sebagai penjelasan yang masuk akal untuk pengamatan ini, yang sesuai dengan penelitian lain pada organisme hibrida (Cassani et al., 1984 ; Kierzkowski et al., 2011 ; Vörös et al., 2007 ) dan penelitian saat ini. Selain menyiratkan efek dosis genetik pada jumlah total vertebra melalui triploidi, hasil penelitian saat ini menunjukkan efek paternal yang kuat pada jumlah total vertebra saat membandingkan individu homozigot dan heterozigot isogenik dari ibu yang sama.
Pekerjaan pionir oleh Schmidt ( 1919 ) mengindikasikan bahwa jumlah vertebra maternal juga dapat memengaruhi heritabilitas; jika induk memiliki jumlah vertebra yang tinggi, efek maternal kuat, sedangkan tidak jika induk memiliki jumlah vertebra yang rendah. Jika pola serupa ada pada salmon Atlantik, hasil kami mungkin menyiratkan jumlah vertebra paternal yang lebih tinggi daripada maternal dalam studi saat ini. Dalam studi saat ini, kami tidak menilai jumlah vertebra maternal dan paternal. Lebih jauh, suhu selama perkembangan awal dapat memengaruhi efek maternal; pada stickleback tiga duri ( G. aculeatus L. 1758), Lindsey ( 1962 ) menemukan korelasi positif antara jumlah vertebra maternal dan keturunan di bawah 21°C, sedangkan korelasi negatif pada suhu yang lebih tinggi.
Studi saat ini menunjukkan kontribusi paternal terhadap peningkatan jumlah vertebra di daerah kaudal pada keturunan jantan. Khususnya, Lindsey ( 1962 ) menemukan efek maternal pada jumlah vertebra abdomen pada keturunan betina pada ikan stickleback berduri tiga. Melihat perbedaan antara ikan heterozigot diploid dan triploid dalam studi saat ini, mungkin menunjukkan kontribusi maternal terhadap berkurangnya jumlah vertebra kaudal dan transisional dan peningkatan jumlah vertebra abdomen, yang menghasilkan vertebra abdomen yang relatif lebih banyak. Dengan demikian, ini dapat memengaruhi ukuran rongga abdomen dan kemampuan untuk menghasilkan gamet, yang sangat penting untuk kesuburan betina. Triploid saat ini semuanya jantan, tetapi hasilnya mungkin masih mencerminkan kemungkinan kontribusi betina terhadap peningkatan kapasitas produksi telur, yang juga terlihat pada keturunan jantan. Sulit untuk menyimpulkan aspek-aspek ini, karena tidak mungkin membuat ikan triploid homozigot semuanya betina dengan pendekatan saat ini.
Dalam pandangan yang lebih luas, misalnya, telah ditunjukkan bahwa populasi anadromous memiliki jumlah vertebra yang lebih banyak daripada populasi non-anadromous dalam spesies yang sama, yang telah disarankan sebagai adaptasi yang menguntungkan terhadap lingkungan laut (Goin et al., 2008 ; McDowall, 2003 ). Informasi tentang identitas regional, yang saat ini tidak diketahui, dapat mengungkapkan apakah sifat tersebut kemungkinan besar terkait dengan reproduksi atau kemampuan berenang. Memang, McDowall ( 2003 ) menyarankan adanya hubungan dengan viskositas air, karena air laut memiliki viskositas yang lebih tinggi daripada air tawar, di mana lebih banyak vertebra dapat mendukung fleksibilitas dan kemampuan berenang yang lebih tinggi di air laut.
4.3 Tingkat, lokasi, tingkat keparahan dan jenis deformitas vertebra dipengaruhi oleh heterozigositas dan ploidi
Triploid saat ini ditantang dengan suhu inkubasi suboptimal pada 8°C (Fraser et al., 2015 ) dan diet yang diadaptasi-diploid (Fjelldal et al., 2016 ) untuk memprovokasi deformitas vertebra di bawah sirip punggung (Fjelldal & Hansen, 2010 ). Pendekatan itu berhasil, dan ikan heterozigot triploid mengembangkan tingkat deformitas vertebra yang tinggi, dengan kompresi dan fusi (tipe 6, Witten et al., 2009 ) sebagai jenis deformitas dominan dan vertebra nomor 27 sebagai vertebra yang paling sering terpengaruh. Ikan homozigot diploid mengembangkan kejadian deformitas dan tingkat keparahan yang sama dengan triploid, tetapi jenis deformitas dominan adalah fusi lengkap (tipe 7), dan vertebra nomor 16 paling sering terpengaruh. Dengan demikian, deformitas pada ikan homozigot diploid lebih ringan dibandingkan dengan triploid, karena fusi lengkap ini telah diremodel menjadi vertebra memanjang amfikoel normal dengan banyak duri saraf dan duri rusuk/hemal (Witten et al., 2006 ). Fusi lengkap memang merupakan tipe deformitas dominan pada salmon Atlantik liar, yang bergantung pada kolom vertebra fungsional anatomi untuk migrasi jarak jauh dan pintu masuk sungai untuk pemijahan (Sambraus et al., 2014 ). Sejalan dengan penelitian saat ini, Shikano et al. ( 2005 ) menemukan penurunan tingkat vertebra yang menyatu dengan dua duri saraf dan hemal dengan meningkatnya heterozigositas pada ikan guppy ( Poecilia reticulata W. Peters, 1859). Tulang belakang yang menyatu dan dibentuk ulang juga dilaporkan dominan pada mutan ikan zebra bungkuk ( Danio rerio F. Hamilton, 1822) (König et al., 1999 ). Bahwa ikan homozigot diploid mengembangkan puncak deformitas yang jelas pada vertebra nomor 16 merupakan pengamatan yang menarik. Penelitian lebih lanjut harus memeriksa apakah fenotipe deformitas ini terkait dengan heterozigositas dan/atau dapat digunakan sebagai penanda untuk genotipe yang tidak diinginkan.
5 KESIMPULAN
Hasil penelitian saat ini menunjukkan bahwa kemampuan untuk memasuki mode pertumbuhan bawah atau atas sebagai parr bergantung pada suhu inkubasi embrio dan ditetapkan sebelum pemberian makanan pertama. Bahwa mode pertumbuhan yang berbeda muncul pada ikan isogenik menunjukkan adanya keterlibatan mekanisme epigenetik. Lebih jauh, hasil penelitian menunjukkan efek dosis maternal yang kuat pada jumlah lepidotrich sirip ekor, sedangkan untuk jumlah total vertebra dan jumlah pterygiophore sirip dorsal dan dubur, keberadaan kromosom maternal ekstra tampaknya mengesampingkan kontribusi paternal. Perkembangan deformitas vertebra pada ikan homozigot tampaknya didukung oleh mekanisme perbaikan aktif.
